优化后的QuEChERs方法测定不同基质中百菌清农药残留

刘 贺,张 鹏,孙利东,彭 菲 马 玲,刘振伟,田国辉

(1.满洲里海关技术中心 食品实验室,满洲里021400;2.黑龙江大学 功能无机材料化学教育部重点实验室,哈尔滨 150080)

0 引 言

施用农药是农业系统中通过控制昆虫、真菌、杂草和其他有害生物来减少作物损失、提高产量、提高作物质量所使用的主要方法之一[1]。百菌清(Chlorothalonil,CTN)是一种高效、低排的非内息性、广谱、保护性有机氯杀菌剂[2-3],被广泛喷洒于花卉、果蔬、粮食等作物用于病虫害的防治。百菌清是酶活性抑制剂,通常认为其作用机理是与真菌细胞中的三磷酸甘油脱氢酶中的半胱氨酸的蛋白质相结合,使真菌细胞的新陈代谢受破坏失去生命力达到抑菌目的[4-5]。然而百菌清良好的黏着性导致其在果蔬、土壤及水体中产生较大的残留,直接对生态环境和人体健康造成严重危害[6]。该农药性质稳定,根据土壤理化性质不同,半衰期最长可达6个月之久,残效期长,具有明显的毒性蓄积[7]。2017年10月27日,世界卫生组织国际癌症研究机构公布了致癌物质清单,百菌清在2B类致癌清单中[8]。2020年,欧盟正式决定实施对百菌清的禁令[9],因此,食品中百菌清残留的检测日益受到人们的重视。

目前,针对果蔬中百菌清残留量检测方法主要有高效液相色谱法[10-11]、气相色谱法[12-14]和气相色谱-质谱法[15-16]等技术。王天丽等用Florisil柱富集、净化,用乙酸乙酯洗脱GC-ECD检测环境水样中百菌清农药残留[17];李旭霞用HLB固相萃取小柱,全自动固相萃取-气质联用法检测地表水中百菌清农药残留[18];李凌云等用乙腈提取,盐析后离心,膜过滤后使用液相色谱-串联质谱法测定蔬菜中百菌清残留量的方法[19]。上述百菌清的前处理检测技术步骤繁多,提取剂消耗量大,既浪费又对环境造成二次污染,部分提取后不经净化步骤,会增加仪器维护频率,不符合大批量检测的要求。

QuEChERs前处理方法是近年来国际上运用最广泛的一种样品前处理技术,由美国Anastassiades教授等于2003年开发,其原理是利用吸附剂填料吸附基质中的杂质从而达到净化的目的[20]。根据样品基质中的杂质不同,吸附剂的选择及用量也不同。本研究设计建立了一种优化后的QuEChERs前处理方法,使用N-丙基乙二胺、C18粉末(ODS)、多壁碳纳米管为吸附剂进行净化,使用气相色谱-电子捕获检测器检测果蔬中百菌清残留量,对比不同仪器检测百菌清的检出限与定量限,通过考察回收率与精密度的数值,确定该方法的实用性,以期满足果蔬中百菌清残留量的快速检测要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

BS 150A电子天平(上海有声恒器有限公司);XW-200E型漩涡混合器(上海青浦泸西仪器厂);HC-3518型离心机(安徽中科);氮气发生器(美国Parker公司);Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司);气相色谱仪(美国Agilent科技有限公司),电子捕获检测器(ECD)。

百菌清农药标准品(德国Dr.Ehrenstorfer公司,纯度大于99 %);正己烷、冰乙酸(分析纯,上海展云化工有限公司);乙腈 (色谱纯,美国TEDIA公司);丙酮(色谱纯,上海化学试剂厂);硫酸镁、乙酸钠(分析纯,天津富裕化工厂);0.22 μm微孔有机滤膜(上海安谱实验股份科技有限公司);N-丙基乙二胺(PSA)、C18粉末(ODS)(天津博纳艾杰尔公司);多壁碳纳米管(MWCNTs)(中国科学院成都有机化学有限公司),所有用水均为去离子水。

1.2 GC-ECD仪器检测条件

气相色谱仪配有电子捕获检测器(ECD);色谱柱：HP-5 (30 m×0.32 mm×0.25 μm);载气：氮气(纯度≥99.999%);柱流速1.0 mL·min-1;柱温：45 ℃保持2 min,以6 ℃·min-1升温至270 ℃,保持8 min;进样口温度：190 ℃;检测器温度：320 ℃;进样方式：不分流进样;进样量：1 μL。

1.3 百菌清标准储备液配制

称取百菌清农药标准品1.0 mg于100 mL容量瓶中,用正己烷稀释,配制成1 000 mg·L-1的标准储备液,将其放置在低温(0～4 ℃)环境中储存。

1.4 样品前处理

称取果菜样品10.00 g于50 mL离心管中,加入10 mL 1%乙酸-乙腈混合溶液,漩涡1 min使其充分混匀,加入陶瓷均质子,加入5 g硫酸镁和1.5 g乙酸钠,剧烈振摇后,漩涡1 min使其混合均匀,4 200 r·min-1离心分离5 min,使有机相与水相分层。移取6 mL上层清液至装有吸附材料(硫酸镁900 mg,PSA 150 mg,MWCNTs 15 mg)的15 mL离心管中,充分漩涡使其混合均匀,4 200 r·min-1离心分离5 min。准确吸取2 mL上清液移入15 mL浓缩瓶中,在40 ℃水浴中氮气条件下吹至近干,以丙酮∶正己烷(1∶1)混合溶液复溶定容至1 mL,使用有机系滤膜(0.22 μm)过滤,使用GC-ECD分析测定。

1.5 基质标准曲线的绘制

准确吸取1.3中制备的百菌清标准储备液1.00 mL(精确到0.01 mL)于10 mL容量瓶中,用正己烷定容,配制成100 mg·L-1的溶液。移取1.00 mL 100 mg·L-1标准溶液并于40 ℃水浴中氮吹至近干,使用不同的果蔬(番茄、黄瓜、芒果和奇异果)空白基质溶液将其复溶,随后使用空白基质逐级稀释配制成0.000 625、0.001 25、0.002 5、0.00 5、0.01和0.1 mg·L-1系列基质标准溶液,在1.2中色谱条件下进样检测,得到百菌清基质色谱图。以峰面积(A)为纵坐标、百菌清浓度(C)为横坐标绘制基质标准曲线,并拟合得到线性方程及线性相关系数。基质标准溶液现配现用。

1.6 添加回收实验

在称量好的空白果蔬样品(芒果)中添加一定量的标准储备溶液,使添加水平分别为0.05、0.10和0.50 mg·kg-1,每个浓度水平重复6次,同时设立空白对照,计算回收率和相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)。

2 结果与分析

2.1 提取溶剂的选择

根据待测物百菌清农药在有机试剂的溶解性,对比提取溶剂分为丙酮、乙腈和1%乙酸-乙腈溶液时果蔬中百菌清的回收率,结果如图1所示。可以看出,百菌清农药在1%乙酸-乙腈中的回收率均明显高于在丙酮和乙腈中的回收率,在乙腈中加入少量的乙酸,使溶液变为酸性,更有利于提高百菌清的提取效率。因此,采用1%乙腈-冰乙酸溶液进行提取。

图1 百菌清农药在不同提取溶剂中的回收率Fig.1 Recovery rates of chlorothalonil pesticide in different extraction solvents

图2 百菌清农药的标准色谱图Fig.2 Standard chromatogram of chlorothalonil pesticide

2.2 色素吸附剂的选择及用量

在水果蔬菜检验中,仅使用PSA和C18时,会出现无法去除色素的问题,造成杂质峰过多,影响检测精度,也易造成气相色谱进样口和色谱柱的污染。常规QuEChERs前处理方法使用的色素吸附剂通常为石墨化炭黑(Graphitized carbon black,GCB),由于GCB表面的正六元环结构,使其对平面分子有极强的亲和力,在吸附果蔬的色素和甾醇等杂质的同时,会吸附很多平面结构的农药,而百菌清恰好为平面结构。选择了两种色素吸附剂,三种用量,使用黄瓜基质,添加百菌清0.50 mg·kg-1,回收率结果如表1所示。实验结果也验证了猜测,具有平面结构的百菌清不适宜使用GCB作为色素吸附剂。而MWCNTs作为除色剂,对平面结构的农药吸附较小,回收率比较稳定,所以选择MWCNTs作为色素吸附剂。随着MWCNTs用量的增加,回收率呈小幅降低,故确定MWCNTs的最佳使用量为15 mg。

表1 两种色素吸附剂回收率实验Table 1 Recovery rate experiments of two kinds of pigment adsorbent

2.3 线性范围、检出限和定量限结果分析

在农药残留检测过程中,由于果蔬样品色素、有机酸、糖类的含量较多,会出现过多杂质峰干扰检测结果,同时易形成基质效应。为了减少杂质峰及基质效应的影响,采用基质标准曲线进行结果分析。建立百菌清基质标准曲线,进行线性回归计算。信噪比为3时,对应样品的质量浓度为检出限;信噪比为10时,对应样品的质量浓度为定量限。检测结果如表1所示,实验表明,百菌清在果蔬样品中,相关系数(R)为0.99以上,线性范围为0.0006 3～0.1 mg·L-1;检出限为0.000 63 mg·kg-1,定量限为0.001 9 mg·kg-1。符合我国国家标准GB 2763-2019《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》规定的限量要求[21]。

2.4 与其他仪器检测方法对比

将本文结果与文献中不同仪器检测果蔬中百菌清残留量的定量限与检出限对比,如表2所示。本文方法测得的最低检出限与定量限分别为0.000 63和0.00 19 mg·kg-1,明显低于其他仪器检测方法,具有更低的检出限与更高的灵敏度。

表2 不同果蔬样品中百菌清的线性方程、相关系数、定量限和检出限Table 2 Linear relationship,correlation coefficient,quantification limit and detection limit of chlorothalonil in different fruit and vegetable samples

2.5 回收率与RSD结果分析

对不同果蔬样品进行添加回和相对标准偏差实验研究。进行低、中、高三个不同浓度添加水平回收试验,加标水平分别为0.05、0.10和0.50 mg·kg-1,每个水平做6个平行样品测定,在不同基质中加入标准溶液后充分混匀,使百菌清与果蔬样品充分接触,依照1.2实验方法进行检测分析,检测结果如表3所示。结果表明,百菌清样品回收率为93%～105%,RSD为1.7%～5.8%,均符合农药残留分析检测要求[24]。

表3 不同仪器检测果蔬中百菌清的检出限与定量限的对比Table 3 Comparison of detection limit and quantification limit of chlorothalonil in fruits and vegetables by different instruments

表4 百菌清的添加回收率、RSD及重复性(n=6)Table 4 Recovery rate,RSD and repeatability of chlorothalonil (n=6)

运用本文建立的方法对市售果蔬共307个样品进行检测监控,按1.4方法进行样品前处理,按照1.2仪器条件进行测试分析,结果显示,所有果蔬中百菌清农药残留均低于检出限。

3 结 论

建立了测定常见果蔬中百菌清残留量的QuEChERs-GC-ECD快速检测方法。采用1%乙酸乙腈提取,15 mg多壁碳纳米管作为色素吸附剂,使用GC-ECD进行检测,具有检测限低、操作简单、重现性好、准确率高和结果可靠的优点,其检测成本低,检测时间短,满足大批量快速检测的要求,具有实际应用价值,同时也为果蔬中其他农药残留检测提供可借鉴的方法。