基于组织病理学的大鼠脑干原发性功能损伤程度研究#

傅倩颖 石菁菁 王国祥 朱林娜 王讯 杨袖菊 刘盛雄Δ

（1.重庆理工大学药学与生物工程学院，重庆 400054；2.重庆大学生物工程学院，重庆 400030）

弥散性轴索损伤（Diffuse axonal injury，DAI）是指头部遭受钝性外力作用后引起的以脑白质轴索弥散性损伤为主要特征的一种脑损伤[1]，与创伤性脑损伤（Traumatic brain injury，TBI）密切相关[2,3]，是导致TBI 患者严重神经功能障碍、植物生存和死亡的最重要原因之一[4]。中国TBI 中心统计了2014～2017 年间13627 例颅脑损伤病例[5]，10334 例为轻微至中度TBI 病人，道路交通事故是这些TBI 患者的主要损伤原因（6548 例，占总病例的50%），男性多于女性。据公安部统计[6]，2020 年全国共发生244674 起交通事故，交通事故导致的死亡人数中，1/3～1/2 为创伤性颅脑损伤TBI。美国每年约发生210 万例TBI，在非占位性TBI 死亡率和致残率中DAI 占35%[7,8]。DAI多见于道路交通事故、高坠和头部钝性打击等[9]。交通事故导致的伤残形势严峻，而医学上使用格拉斯哥昏迷评分法（Glasgow coma scale，GCS）评估病人昏迷程度[10]，或者基于头部碰撞标准（Head injury criterion，HIC）、累计应变损伤指标（Cumulative strain damage measure，CSDM）等方法以软组织变形、水肿、出血和骨折等对颅脑进行损伤评判[11,12]，对交通事故所致的伤情调查研究普遍采用简明损伤评分（Abbreviated injury scale，AIS）等[13]，现有的损伤评级标准缺少神经损伤造成的病理性功能障碍程度的客观标准。如何更有效地在脑损伤发生早期就对脑损伤程度有一个明确的判断对后续进行脑部诊断、治疗和恢复起着重要作用[14]。为此，我们用苏木精-伊红（Hematoxylin eosin staining，HE）染色结合β-淀粉样前体蛋白（β-Amyloid precursor protein，β-APP）免疫组织化学染色法，对实验组大鼠脑干进行不同程度的原发性致伤，对脑干损伤程度进行定量分类。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

选24 只成年健康SD 雄性大鼠（由辽宁长生生物技术股份有限公司（许可证号NO.SCXK（辽）2020-0001 提供），体质量300～400 g，随机分为正常对照组、1.25 m 致伤实验组和2.25 m 致伤实验组，共3 组，每组8 只。实验前将大鼠放置在安静、室温22～28℃、避强光的环境内适应性饲养。

1.2 模型制作

经典的Marmarou 模型是最常用的弥漫性脑损伤动物模型之一，在本次实验中参考韦恩州立大学（Wayne state university，WSU）改进的Marmarou 撞击加速度模型[9]，并在实验室搭建，以测量大鼠头部在撞击过程中的实时机械损伤和反应。操作如下：SD 大鼠编号称重之后，所有大鼠均用0.4%戊巴比妥钠（40 mg•kg-1）腹腔注射麻醉。麻醉完成后，给大鼠在颅骨顶端戴上规格为直径10 mm、厚度3 mm 的金属圆铁片，将大鼠俯卧位固定于已知弹性系数的聚氨酯泡沫上，使用同一450 g 重量的砝码分别从1.25 m 和2.25 m高处自由落体垂直打击，打击后立刻移开聚氨酯泡沫以免砝码误伤，并立刻对大鼠进行过量麻醉致死，取大鼠脑干部分用4%多聚甲醛固定24～48 h。正常对照组不作任何操作而直接过量麻醉致死取材。

1.3 HE 染色

将固定好的组织剥离小脑，用梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋、切片（厚度7 μm）、梯度乙醇脱腊到水，苏木素-伊红染色，脱水封片，电子显微镜下观察。为了尽可能准确统计大鼠脑干及锥体束出血程度，在切片过程中，取距延髓-脊髓交界处2 mm 计作a 位置，再后移1.5 mm 和3 mm 计作b、c 位置冠状切面取材。利用Olympus正置荧光显微镜采像系统拍摄HE 切片中大鼠脑干和锥体束区域，在10×100 倍视野下每张片子随机选取4 个视野，依次对切片观察采像。计算各组在脑干区域的细胞水肿个数，每见1 处计数1。在Image J 1.53 系统软件中对每张片子进行图像处理，手动勾画出血部分区域进行百分比计算。

1.4 免疫组织化学染色

兔抗鼠β-APP 单克隆抗体购于武汉博士德生物工程公司，免疫组织化学染色试剂盒均购于北京博奥森生物技术有限公司。按照说明书的染色方法对大鼠脑干b 位置切片进行染色观察。在滴加封闭血清和一抗前需进行柠檬酸缓冲液高温抗原修复，其中一抗的浓度为500 μg∙mL-1，按照1:250 的稀释比例进行稀释，并设置空白及阴性对照。对β-APP 免疫组化染色结果在光镜下400 倍，取脑干区4 个面积均为0.48 mm2的不重复视野，用Image J 1.53 系统软件测量计算阳性细胞面积和累积光密度值（Integral optical density，IOD）。

1.5 实验数据统计处理方法

完成数据采集后采用SPSS 26、Graphpad Prism 8.0 统计分析软件对数据进行统计分析处理。计量资料以均数±标准差（）表示，采用双因素方差分析；计数资料以例数（%）表示，采用相关性检验。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 肉眼观察

实验组大鼠使用0.4%戊巴比妥钠（40 mg•kg-1）进行过量麻醉处死后，取全脑进行脑表面及冠状切片检查，不同致伤高度组大鼠脑干位置均可见血管扩张淤血，对照组大鼠脑干表面未见明显淤血。

2.2 HE 染色观察

大鼠脑干组织经石蜡切片HE 染色后，光镜下正常对照组的大鼠脑干结构清晰完整，神经束排列整齐，细胞周围间隙致密，出血量少，偶有出血点，常呈分散点状，见图1A～1C 中正常组大鼠脑干切片；同一大鼠的脑干a、b、c 位置之间的切片区别不是非常明显，相对比之下，在c 位置的出血点数量多于a、b 位置的切片。

致伤组可见锥体束及脑干部位出现神经束疏松、紊乱、血管淤滞，胞核皱缩或溶解、破裂，出现细胞外间隙扩大，脑细胞体检增大的脑水肿现象，神经元及微血管周隙呈海绵状或空泡样，见图1D～1F 中1.25 m 致伤组大鼠脑干切片。对比正常对照组，1.25 m 损伤组内，出血点呈分散点状和长条型出血混合，出现血管源性水肿。在2.25 m 损伤组内，出血点以长条型出血居多，且常见淤血，神经细胞周围间隙扩大。脑水肿个数增加，出现血管源性脑水肿和细胞毒性脑水肿，多见血管源性脑水肿。对比正常组和1.25 m 致伤组同一位置切片，可见出血面积明显密集且增加，同一损伤大鼠的脑干a、b、c 位置切片的出血量呈逐步上升趋势，见图1G～1I 为2.25 m 致伤组大鼠脑干切片。

为了更好的观察对比不同致伤高度下大鼠脑干区域和锥体束区域出血量和脑细胞水肿个数的变化，我们通过Image J 1.53 软件对各组大鼠脑干和锥体束出血面积占比进行计算，再采用IBM SPSS Statistics 26、Graphpad Prism 8.0 统计分析软件对数据进行统计分析处理，结果如图1J～1O 所示。在图1J、1L、1N 中，可以观察到随着致伤高度的增加，在脑干和锥体束位置的损伤也逐步加深；双因素方差分析结果发现，不同致伤高度对脑干区域出血面积占比、脑水肿个数和锥体束出血面积占比的影响存在明显差异（P＜0.01）；而在图1K、1M、1O 中可以发现，脑干区域出血面积占比和锥体束出血面积占比随着切片位置越接近脑干而越大，而脑水肿数量则无此变化；双因素方差分析结果也发现切片部位距脑干远近的不同对脑干区域出血面积占比和锥体束出血面积占比的影响存在明显差异（P＜0.01），而对脑水肿数量不存在明显差异（P＞0.01）。

2.3 免疫组织化学染色观察

经过对大鼠脑干HE 染色a、b、c 位置的观察，我们发现在b 位置进行实验观察的效果最为稳定，因此在对大鼠脑干β-APP 免疫组化实验中，我们集中选择了b 位置进行实验。正常对照组脑干区域神经细胞胞浆及细小血管周围偶见β-APP染色呈弱阳性反应，不同致伤高度分组在光镜下脑干区域神经细胞胞浆及细小血管周围β-APP 染色棕色阳性增强，并且范围逐步扩大，见图2A、2C、2E。在1.25m 致伤组可在脑干区域偶见轴索损伤，开始出现β-APP 阳性棕色颗粒分布。在2.25m 致伤组可在脑干区域见到轻度轴索肿胀、断裂、扭曲变形、末端膨大等，在脑干中线周围分布的β-APP 阳性细胞面积明显增多。

观察β-APP 在锥体束区域的变化发现，随着致伤强度的增加，β-APP 染色的阳性表达增强，轴索病理改变更明显，见图2B、2D、2F。通过Image J 1.53 软件对大鼠脑干β-APP 免疫组化染色进行读取，计算β-APP 阳性细胞面积IOD 值，发现0 m 正常组的IOD 值为0.15±0.12，而1.25 m和2.25 m致伤实验组的IOD值分别为0.51±0.24和1.03±0.23。随着致伤程度的加深，β-APP 阳性细胞面积及IOD 值呈持续升高（P＜0.05）。

2.4 数据相关性分析

为了分析不同损伤程度脑组织切片的HE 染色分析与β-APP 免疫组化染色的相关性，我们选取了脑干相同位置的HE 染色数据和β-APP 免疫组织化学检测数据做相关性分析，见表1。正常组和致伤组大鼠脑干组织切片感兴趣区域内测定的β-APP 的阳性细胞面积和IOD 值与HE 染色的脑干区域的出血面积占比和锥体束出血面积占比呈正相关。

表1 不同致伤高度下大鼠脑干b 位置脑干出血占比、脑水肿个数、锥体束出血占比和阳性细胞面积、IOD 值的皮尔逊相关性分析

3 讨论

DAI 是一种常见的脑损伤，目前认为DAI 的发生机制是由于交通事故、高坠或暴力作用于头部产生角加速度，在脑组织内引起剪切作用，使神经纤维断裂，形成原发性轴索损伤所致。DAI 的形成涉及一系列病理生理学变化过程[16]，脑损伤后血管网损伤、Ca2+超载、线粒体损伤、轴索结构损伤、轴索转运障碍、继发性缺血缺氧、水肿、炎性反应、自由基、胶质细胞反应性增生等病理生理学反应不仅可加重轴索损伤，且对DAI 的发展及转归也起重要作用。DAI 可单独导致死亡，并作为损伤致死的诊断依据[17]，而在实际案例中，DAI 的发生常常还伴随着其他相关重型脑损伤。因此，研究原发性DAI 损伤是具有医学病理实际意义的。Marmarou 模型可稳定、可靠地复制大鼠DAI 模型。本实验参考美国韦恩州立大学改进的Marmarou 模型[9]，自制DAI 动物实验装置，可较为理想地建立不同损伤高度的DAI 动物模型。

β-APP 是一种广泛存在于全身组织[18]，具有膜受体蛋白样结构的大分子膜糖蛋白，正常脑组织其表达水平很低而不易被检测。Smith 等研究表明[19]，DAI 后，受损的轴索可能是β-APP 的储存器，并且它可以释放到周围脑实质。Ekmark-Lewen 等研究也发现DAI 发生后β-APP 在脑组织中的含量显著升高[20]。在脑组织力学损伤作用下，轴索受损后发生轴浆运输障碍，引起β-APP 在损伤部位异常聚集、表达上调，损伤早期可发现β-APP 在轴索内积聚，逐步增强，且具有一定的时空性，是轴索损伤的主要机制和重要病理标志，β-APP 阳性染色轴索的数量和含量与损伤程度、时间长短、动物年龄及代谢状态都密切相关。因此β-APP 常被作为检测轴索损伤的标志物[19]，对轴索损伤有很好的提示作用。Reichard 等应用β-APP 评估非事故性中枢神经系统损伤（Nonaccidental central nervous system injury，NAI）[21],对28 例NAI 患者研究发现，27 例患者出现轴索β-APP 阳性染色。22 例系继发于脑水肿及血管收缩引起的供血不足，称为血管性轴索损伤（Vascular axonal injury，VAI），19 例为DAI，16例同时存在VAI 和DAI，表明缺血也是轴索损伤的一个重要原因。

在道路交通事故或高坠所致的颅脑损伤中，脑干是脑损伤的好发部位。脑干自下而上由中脑、脑桥、延髓三部分组成[22]，是大脑、小脑与脊髓相互联系的重要通路。Marmarou 模型造成的脑干轴索损伤主要集中于脑干纵行纤维束包括锥体束、内侧纵束等[15]。锥体束行经脑干腹侧面，是大脑皮层下行控制躯体运动的最直接通路[23]，其功能主要是发动和管理骨骼肌的运动。在发生脑损伤时，脑干发生损伤使锥体束受累，则必然会引起在锥体束组织内一系列的病生理变化，伴随着出现出血、水肿、神经束紊乱等现象。大脑中水的分布非常广泛，包括脑脊液、血液、细胞内液、组织液等，由于渗透压和细胞内外电解质的不同，细胞、脑室和细胞间隙的液体交换对保持脑组织正常功能有重要作用[24]。有学者将由脉管系统、神经元、星形胶质细胞组成的神经血管网络命名为“脑类淋巴系统”[25]，它们通过多种通路调控神经胶质和血管之间的水分子运动，对调控水分子的正常分布至关重要。

但是既往研究未见涉及锥体束出血面积占比和β-APP 在不同程度DAI 损伤后的定量变化及其相关性分析。正是基于此，本文通过HE 染色定量测量了脑干感兴趣区域的出血面积占比和锥体束区域的出血面积占比，计量了脑干感兴趣区域的脑水肿个数，并且在脑干延髓位置选取自下而上的a、b、c 三个位置。定量计算后的结果显示，随着脑干位置越接近大脑的位置，脑干和锥体束区域在不同程度的致伤后出血面积占比越高，而脑水肿个数和脑干位置没有明显关系；随着脑干致伤程度的加深，脑干区域的平均出血面积占比、平均脑水肿个数和平均锥体束出血面积占比均持续上升，且差异显著。随后，结合β-APP 免疫组织化学实验，在2.25 m 致伤组中可以观察到轻度的典型DAI 轴索损伤改变，证明在本实验条件下该模型稳定、可靠。分析测量的阳性细胞面积和IOD 值可以发现HE 染色中脑干和锥体束位置的出血面积占比变化与β-APP 阳性细胞面积和IOD 值随致伤程度变化的趋势相对应，且互相之间呈正相关，说明HE 染色中的出血面积占比变化对于判断评价大鼠脑干原发性功能损伤程度具有一定的可行性。

本课题以大鼠脑干原发性DAI 为基础，结合HE 染色和β-APP 免疫组化实验，为定量研究神经功能损伤程度提供了新的思路方法。β-APP 常被作为检测DAI 损伤的标志物，本实验采用双盲法，通过β-APP 阳性细胞面积和IOD 值评价脑干损伤的严重程度具有准确性，后续研究还需要进一步增加动物数量，探究β-APP 蛋白的分布位置对评估脑损伤严重程度是否有相关性。