芪仁通脉合剂中枳实的薄层色谱鉴别研究

赵娟娟 陆蕙兰 叶侃倜 叶芷希 杨骏

（上海市黄浦区香山中医医院 上海 200020）

芪仁通脉合剂是上海市黄浦区香山中医医院的医院制剂，处方由黄芪、燀桃仁、蜜麸炒枳实、当归、川芎、赤芍、地黄、牛膝、牡丹皮、炒地龙、桂枝、鸡血藤和白茯苓等13 味中药组成，具有益气养血，活血通络的功效，临床上主要用于治疗动脉硬化，脑及冠状动脉供血不足所致的冠心病、中风、头晕眼花、胸闷心悸、四肢麻木、静脉曲张等症。原制剂质量标准中有枳实的薄层鉴别及水分等常规检查项目，但是通过长期实验积累的数据发现，以枳实对照药材薄层色谱法鉴别枳实，在“枳实对照药材”对应斑点处，供试品显色特别淡，实验结果较不稳定。通过文献分析，枳实中的橙皮苷可作为指标成分进行鉴别[1-5]，因此，为控制药品质量，保证临床用药的安全性和有效性，本研究依据2020 版药典的要求对芪仁通脉合剂原标准项下枳实的鉴别方法加以研究改进，建立新方法，达到薄层色谱法要求的快速、简洁、明了的目的，从而为该制剂质量标准的提高奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器

ATS4 全自动点样仪、Visualizer 2 薄层色谱数码成像系统（瑞士卡玛公司）；ST-40R 高速冷冻离心机、ST-40 高速离心机（赛默飞公司）；MS204TS/02 电子天平、XSE105DU 电子天平（梅特勒-托利多公司）；P120H超声波清洗仪（德国Elma 公司）；TW20 恒温水浴锅（优莱博公司）；KBF(E5.3)恒温恒湿箱（Binder 公司）；Milli-Q Advantage A10 超纯水系统（Millipore 公司）。

1.2 试剂与药材

乙酸乙酯、甲醇、乙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、无水甲酸（General-Reagent 公司）；三氯化铝（麦克林公司）；薄层色谱硅胶预制板（烟台市化学工业研究所）；高效硅胶G 板（青岛海洋化学工业研究所）；HPTLC silica gel 60 F254（德国Merck 公司）。

橙皮苷对照品、枳实（酸橙）对照药材（中国食品药品检定研究院）；芪仁通脉合剂（上海宝龙药业股份有限公司，批号2109001、2111001、2111002）；缺枳实阴性制剂（上海宝龙药业股份有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 供试品制备方法考察

1）供试品溶液 方法1：取芪仁通脉合剂（批号：2109001）10 mL，置于50 mL 离心管中，加二氯甲烷15 mL，振摇提取，离心（3 800 r/min，25 ℃），取上清液，再用乙酸乙酯萃取2 次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液A；方法2：省略二氯甲烷提取，其余按方法1 制备供试品溶液B。

2）对照品溶液 取橙皮苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 的溶液，作为对照品溶液。

3）对照药材溶液 取枳实对照药材0.1 g，同对照品溶液方法制成对照药材溶液。

4）阴性溶液制备 取缺枳实阴性制剂10 mL，同供试品溶液方法制成阴性溶液。

1.3.2 不同展开剂、检视方式及点样量考察

吸取1.3.1 项下供试品溶液、橙皮苷对照品溶液以及阴性制剂溶液，分别将1、2、5 μL 点样于同一高效硅胶G 薄层板上，分别置于展开系统一[乙酸乙酯-无水甲酸-水（10 ∶1 ∶1）]、展开系统二[三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶7 ∶2）10 ℃以下放置的下层溶液]、展开系统三[三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3 ∶8 ∶4 ∶2）10 ℃以下放置的下层溶液]中展层，结束后取出薄层板，晾干，先直接置于254 nm 或365 nm 紫外灯下检视，然后再用2%三氯化铝乙醇溶液喷雾后置于365 nm 紫外灯下检视。

1.3.3 专属性考察

考察3 批芪仁通脉合剂和1 批阴性制剂的薄层色谱行为。

1.3.4 不同薄层板、温、湿度及放置时间考察

考察3 种不同来源的薄层板，不同温度（10、20、30 ℃）、湿度（30%、50%、70%）以及供试品不同放置时间（0、24、48 h）对芪仁通脉合剂提取液薄层色谱行为的影响。

2 结果

2.1 供试品制备方法考察

供试品溶液A 和B 色谱在对照品相应位置均可检出相应条带，两种供试品溶液的色谱行为基本一致，说明增加二氯甲烷萃取，仅能减少溶剂前沿部分的干扰，未对主斑点部分产生影响，因此选择方法2，即直接乙酸乙酯萃取作为芪仁通脉合剂的供试品溶液的制备方法。

此外，通过供试品色谱、阴性色谱和对照药材色谱（图1）比较可知，对照药材色谱传递到供试品色谱中仅有橙皮苷相应的条带，因此可以采用橙皮苷对照品进行芪仁通脉合剂中枳实的鉴别。

图1 供试品制备方法考察

2.2 不同展开剂考察

3 个展开系统均能在对照品相应位置检出相应条带，且对照品比移值（retention factor, Rf）均在0.3～0.7 之间，供试品溶液色谱行为基本一致，但展开系统一和展开系统二供试品溶液中，在橙皮苷相应色谱位置上方有一条条带与之接近，容易重叠，进而影响鉴别；而展开系统三，各条带分离度好，且阴性均无干扰，因此选择展开系统三作为枳实鉴别的薄层色谱展开系统（图1）。

2.3 不同检视方式考察

显色前，在紫外灯254 nm 下，橙皮苷对照品斑点不清晰，特征性不强，而且阴性色谱在对照品相应位置有干扰条带；在紫外灯365 nm 下，对照品色谱无荧光条带，因此两种条件下均无法鉴别枳实。而三氯化铝乙醇显色后，紫外灯365 nm 下，供试品色谱在对照品色谱相应的位置上，均可检出相同颜色的荧光条带，且阴性无干扰，因此选择显色后的紫外灯365 nm 作为检视方式。

2.4 供试品点样量考察

不同点样量供试品在橙皮苷对照品相应位置均可检出相同颜色的条带，但点样量为2 μL 时，供试品溶液中鉴别条带颜色明显，背景颜色较浅，易于鉴别，因此选择供试品溶液的点样体积为2 μL。

2.5 专属性考察

3 批芪仁通脉合剂提取液和橙皮苷对照品均Rf 0.37处显示相同颜色的荧光条带，而阴性制剂无干扰，说明此方法专属性强，可作为芪仁通脉合剂中枳实薄层鉴别方法（图2）。

图2 枳实的薄层色谱鉴别图

2.6 不同薄层板、温、湿度及供试品放置时间考察

在3 种不同来源薄层板，不同温度和湿度以及供试品不同放置时间条件下，供试品色谱在与橙皮苷对照品色谱相应位置上，均有相同颜色的斑点，分离度良好，且阴性无干扰，说明薄层板种类、温度（10～30 ℃范围内）、湿度（30%～70%范围内）对芪仁通脉合剂的色谱行为影响较小，且供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.7 最佳枳实薄层条件

通过对上述实验参数的考察，优化后的薄层色谱条件为：取芪仁通脉合剂10 mL，置于50 mL 离心管中，用乙酸乙酯萃取两次，每次15 mL，离心后合并乙酸乙酯液，蒸干，残渣加甲醇1 mL 使溶解，作为供试品溶液。取橙皮苷对照品，加甲醇制成每1 mL 含0.3 mg 的溶液，作为对照品溶液。取缺枳实阴性制剂10 mL，同供试品溶液方法制成阴性溶液。吸取上述供试品溶液、阴性溶液各2 μL，对照品溶液10 μL，分别点于同一高效硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（3 ∶8 ∶4 ∶2）10 ℃以下放置的下层溶液为展开剂，以2%三氯化铝乙醇溶液喷雾，晾干后置紫外灯光（365 nm）下检视。

3 讨论

本研究对芪仁通脉合剂中枳实的薄层鉴别条件进行了考察和优化。由于原枳实鉴别方法中，在“枳实对照药材”对应斑点处，供试品显现斑点特别淡，实验结果不稳定，重现性差，通过查阅相关文献[6]，本研究先是对原标准的展开系统进行了改进，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（7.5 ∶2.5 ∶0.5）为展开剂展开，结果显示阴性溶液存在干扰，因此该鉴别方法不可行。研究表明，黄酮类化合物是枳实的主要药效成分，约占总含量的20%，主要包括橙皮苷等[1-2]，目前已有大量文献采用橙皮苷作为枳实的定性和定量检测指标[3-5]，因此本研究考虑采用橙皮苷作为芪仁通脉合剂中枳实的薄层鉴别指标成分。

在对芪仁通脉合剂供试品制备时，还考察了其他制备方法，如用石油醚、乙醚萃取，或用氨水调样品pH 等，结果均因阴性对照干扰、橙皮苷对照品显色不清晰，以及供试品色谱的相应位置未检出对照品的特征斑点等原因而无法进行定性鉴别。

枳实是芪仁通脉合剂的臣药，在该方中起到活血祛瘀的功效，因此对其进行定性鉴别，可在一定程度上反映制剂的质量。但中药成方制剂通常由多味药组成，其药效是多种活性物质综合作用的结果，若只对单味药或单一成分进行检测，难以全面控制制剂的内在质量[7]。因此，本研究后续应考虑增加枳实的含量测定指标，以及君药黄芪、臣药燀桃仁、川芎等其他药味的定性和定量鉴别指标，从而能更好地控制制剂的质量。