采用体外微核试验检测某电子烟液的遗传毒性

杜秀明，张丽婷，徐灵芝

（1．上海化工院检测有限公司，上海 200062；2．上海化工研究院有限公司，上海 200062）

电子烟液又名电子烟油，是配合电子烟使用的电子雾化液。电子烟液通过电子烟雾化器加热，能够产生如香烟一样的雾气，使人吸入剂量不等的尼古丁而获得类似于抽吸传统卷烟的生理感受。电子烟液的主要成分是食用级或者医药级别的丙三醇、1,2-丙二醇、聚乙二醇、烟草专用香精，以及一定含量的烟碱（尼古丁）成分[1-2]。尼古丁，是一种无色至淡黄色透明油状液体，是烟草中含氮生物碱的主要成分，其具有成瘾性和毒性。有相关报道，成人一次吸食6.5～13 mg/kg就可能致死[3]。

国内针对电子烟的研究报道多集中在电子烟组分的分析方法、理化指标的测定等领域[4-6]，国外针对电子烟的研究报道多集中在尼古丁成瘾性及吸食安全性方面的研究[7]。Misra等[8]比较了电子烟液和气溶胶提取物的细胞毒性、炎症反应性、基因毒性。Gao等[9]对传统卷烟、无烟气烟草产品、电子烟、尼古丁进行了DNA损伤评价。2016年，美国食品和药物管理局烟草制品中心敲定了一项“视同”法规，将其烟草相关监管权限扩展至含尼古丁的电子烟中，其研究依据重点包含了对电子烟毒性的研究[10]。

根据《OECD 487化学品测试方法 体外哺乳动物细胞微核试验》的要求，中国仓鼠肺细胞（Chinese hamster lung，CHL）是体外哺乳动物细胞微核试验常用的生物测试体系之一。体外哺乳动物细胞微核试验是遗传毒性组合策略试验之一[11-12]。该试验可以确定和评价化学品诱发体外培养的哺乳动物细胞微核形成的能力，从而判断受试物是否属于致突变物。

目前，未见电子烟液能否诱发体外培养的中国仓鼠肺细胞微核形成的相关报道。为了进一步评估电子烟液的安全性，本研究通过体外微核试验来评价电子烟液的致突变性，为电子烟液的安全使用提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

电子烟液购买于市售商业成品，主要成分为天然植物甘油、医用级丙二醇、植物提取物、天然香精，烟油容量为每颗2 mL，尼古丁含量为30 mg/mL，生产执行标准号为Q/441900DGMK 001-2020。

细胞松弛素B、丝裂霉素C 和环磷酰胺购自于Sigma 公司。秋水仙碱、NADP-Na2和G-6-P-Na2购自于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 细胞培养

中国仓鼠肺细胞购自于中国科学院上海生命科学研究所细胞库。采用RPMI-1640培养液培养，细胞培养于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中。

1.3 受试物浓度的选择

电子烟液不溶于去离子水，选择二甲亚砜作为溶剂。试验选用3个终浓度（1.25、2.50和5.00 μL/mL）检测其对中国仓鼠肺细胞的细胞毒性。染毒前，用移液器吸取500 μL 电子烟液，再移取约500 μL 二甲亚砜定容至1 mL，配成最高剂量为500 μL/mL 的电子烟液母液，通过倍比稀释，获得其他剂量组的电子烟液母液。染毒时，最高剂量组从500 μL/mL的电子烟液母液中移取100 μL，加入9 900 μL 的细胞培养液中，至总体积为10 mL，配成含电子烟液为5.00 μL/mL的细胞培养液，用于细胞染毒培养。其他剂量组或溶剂对照组（二甲亚砜）从对应母液中吸取100 μL电子烟液母液或相同体积的二甲亚砜，分别加入9 900 μL的细胞培养液中，至总体积为10 mL，用于细胞染毒培养。此时二甲亚砜浓度约为0.5%，满足OECD 487中二甲亚砜最高浓度不高于1%的要求。

细胞毒性的确定依据胞质分裂阻断增殖指数（cytokinesis block proliferation index，CBPI）进行判定。

式中，CBPI=1等同于100%细胞生长抑制；500为观察的细胞总数。

式中，T=受试物组，C=溶剂对照组

1.4 试验染毒程序

将适量细胞悬液加入新的12孔板内进行培养，在细胞长势良好，可见大量分裂状态细胞时，在相应12孔板中分别加入不同剂量的试验样品、溶剂对照品或阳性对照品。试验分为有代谢活化系统短时处理组（4 h，+S9）、无代谢活化系统短时处理组（4 h，-S9）和无代谢活化系统连续处理组（24 h，-S9）3 种处理方式，每种处理方式均设溶剂对照组和阳性对照组，所有组别均设两个平行样。短时处理组，试验样品与细胞作用4 h 后弃去培养液，用无血清培养基洗涤2次，然后加入0.02 mL 细胞松弛素B，再用含10%胎牛血清培养基补足至2 mL，继续培养至24 h。无代谢活化系统连续处理组，在不加代谢活化系统条件下，使试验样品和细胞松弛素B 与细胞连续作用约24 h。

1.5 制片和镜检

染毒结束后，弃上清液，用无血清培养基洗涤2次。细胞经低渗、预固定、固定后，用0.1%吖啶橙对每孔进行染色，然后于荧光显微镜下进行镜检。镜检时每个浓度组至少观察2 000 个双核细胞，记录含微核的双核细胞数，镜检结束后进行数据汇总并统计分析。

微核率/‰=（含微核的双核细胞数/观察双核细胞总数）×1 000‰

1.6 统计学方法

采用卡方检验的方法对各组双核细胞微核率进行统计学分析，P＜0.05表示组间差异的比较具有统计学意义。

2 结 果

2.1 电子烟液对中国仓鼠肺细胞的细胞毒性

通过计算胞质分裂阻断增殖指数法来评估电子烟液对中国仓鼠肺细胞的细胞毒性。在测试剂量范围内，随着电子烟液浓度的升高，对中国仓鼠肺细胞的细胞毒性升高。电子烟液在最高测试浓度为5 μL/mL时，（4 h，-S9）、（4 h，+S9）和（24 h，-S9）条件下染毒的细胞毒性分别为18.95%、17.16%和20.30%，具体见表1。所有染毒浓度组对中国仓鼠肺细胞的抑制率均低于50%，依据OECD 指导原则487 的要求，该试验选用的浓度适用于本研究。

表1 电子烟液对中国仓鼠肺细胞的细胞毒性试验结果

2.2 电子烟液对中国仓鼠肺细胞的遗传毒性

本实验通过检测电子烟液诱发体外培养的中国仓鼠肺细胞微核形成率来确定和评估其致突变能力，各剂量组微核率见表2。

表2 电子烟液诱发中国仓鼠肺细胞微核形成的试验结果

试验样品在1.25、2.50 和5.00 μL/mL 剂量下，无代谢活化系统短时处理组（4 h，-S9）的微核率分别为2.50‰、1.50‰及2.50‰，有代谢活化系统短时处理组（4 h，+S9）的微核率分别为1.50‰、2.00‰及1.50‰，无代谢活化系统连续处理组（24 h，-S9）的微核率分别为1.50‰、1.00‰及1.50‰，与溶剂对照组相比差异均无统计学意义（P＞0.05），试验结果为阴性。阳性对照组（4 h，-S9）、（4 h，+S9）及（24 h，-S9）条件下染毒的微核率分别为37.50‰、36.00‰及22.50‰，与溶剂对照组相比差异有统计学意义（P＜0.01），表明试验体系稳定。

3 讨 论

在有和无代谢活化系统处理条件下，各染毒浓度组电子烟液在体外培养的哺乳动物细胞微核试验中为阴性结果，表明该电子烟液在本测试浓度范围内，对CHL细胞无致突变作用。

Trifunovic 等[13]用含尼古丁和不含尼古丁的电子烟液处理V79 肺成纤维细胞，HPRT 试验和彗星试验得到阴性结果，显示其无致突变性，但电子烟液影响了V79 细胞的正常代谢，能诱发V79 肺成纤维细胞线粒体功能损害，使病灶黏附蛋白上调。Platel等[14]通过标准彗星试验、微核试验和Pig-a基因突变试验，比较不同功率电子烟和传统香烟烟雾经口鼻暴露4 d、3个月及6 个月对小鼠遗传毒性和诱变潜力的影响，其研究表明，大功率电子烟和传统香烟能引起小鼠的肺和肝脏细胞的DNA氧化损伤，但彗星试验、微核试验和Pig-a基因突变试验结果亦均为阴性。Thorne等[15]通过体外细胞基因突变试验，比较烟草产生的总颗粒物和电子烟液对L5178Y 细胞致突变性的影响，结果显示，烟草产生的总颗粒物具有致突变性，而电子烟液对L5178Y 细胞无致突变性。Farsalinos 等[16]发现加热后电子烟液形成的产物能诱使细胞发生DNA交联和单双链断裂，如果得不到及时修复，这些可能会导致微核的形成。Guo 等[17]的研究也表明电子烟液可以在不同类型的口腔细胞中诱导DNA损伤、氧化应激、DNA双链断裂、细胞凋亡，临床研究表明电子烟使用者的N'-亚硝基鸟嘌呤、丙烯醛DNA 加合物、基因调节和乳酸脱氢酶表达水平显著高于非使用者，而嘌呤/嘧啶位点水平显著低于非使用者。上述研究结果存在一定差异的原因可能有研究用生物测试体系不同、电子烟液尼古丁含量不同、电子烟液组分不同、染毒方式不同以及检测终点不同等[18-19]。虽然这些研究的结果表明电子烟液能够引起细胞氧化损伤、DNA损伤，但标准遗传毒性试验表明电子烟液对测试生物体系无明确致突变作用，这和我们目前的研究结果相互印证。

综上所述，电子烟液的遗传毒性尚不明确，虽然其能够引起细胞氧化损伤，但还不能确定其是否属于致突变物，还需进一步进行遗传毒性组合试验或探究新的遗传毒性评价方法，以确定电子烟液是否具有遗传毒性。