基于Nrf2/HO-1信号通路研究黛玉膏对肛瘘大鼠血管生成的影响*

郭 伟 闫丽霞 常少青 刘振丽

(1.保定市第二医院 肛肠科,保定 071050)(2.河北省第七医院 影像科,保定 073000)

肛瘘是指直肠或肛管与肛周皮肤相通所形成的异常通道,中医称为“肛漏”“痔漏”“穿肠漏”等,为常见肛肠疾病,患病率为8.6/105例[1]。肛瘘治疗以手术为主,但术后存在疼痛剧烈、创面愈合缓慢等问题[2]。中医药外用在肛瘘治疗中具有独特优势[3]。黛玉膏针对肛瘘湿热郁结而致痈溃不愈的病机而设,能够收湿敛疮、生肌止血,临床研究表明其能缩短创面愈合时间,减轻术后并发症,可能与提高创面血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)水平有关[4]。为进一步明确其作用靶点,本研究通过建立大鼠模型,深入探讨其干预的信号通路,为临床应用提供新的依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:10周龄雄性SPF级SD大鼠(200±20)g共30只,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号【SCXK(京)2021-0011】,使用许可证号【SYXK(京)2017-0023】。适应性饲养5 d,室温(22±2)℃,采用12 h∶12 h昼夜间断照明,自由饮食饮水。本实验已通过保定市第二医院福利伦理审查,审查编号:IACUC-20210307-12。

1.1.2主要试剂和仪器:黛玉膏(由保定市第二医院药剂科加工制备,组成成分:煅炉甘石7.5 g,煅石膏107.5 g,赤石脂7.5 g,青黛50 g,滑石100 g,黄柏50 g,药物混合充分研磨成粉,过100目筛2次,加入麻油调成膏剂备用);大鼠VEGF ELISA检测试剂盒、大鼠血管VEGFR ELISA检测试剂盒(上海将来实业股份有限公司)、大鼠血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)ELISA检测试剂盒(北京诺为生物技术有限公司)、大鼠表皮细胞生长因子(epidermal growth factor,EGF)ELISA检测试剂盒、大鼠白细胞介素(interleukin,IL)-1β ELISA检测试剂盒、大鼠IL-6 ELISA检测试剂盒、大鼠IL-10 ELISA检测试剂盒、大鼠肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)ELISA检测试剂盒(均碧云天生物技术研究所)、兔抗核因子2相关因子2(nuclear factor erythroiD-2-related factor 2,Nrf2)一抗(ab137550)、兔抗血红素氧合酶1(heme oxygenase-1,HO-1)一抗(ab52947)、兔抗CD31一抗(ab182981)、兔抗β-actin一抗(ab8227),试剂购自艾博抗(上海)贸易有限公司。

PeriFlux 5000型激光多普勒血流仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司);5804R高速冷冻离心机(德国艾本德股份公司);奥林巴斯生物显微镜 OLYMPUS BX43(日本奥林巴斯株式会社);BioTek ELx808酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);164505电泳系统、ChemiDoc XRS+化学发光成像系统(伯乐公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠肛瘘模型的建立及分组:采用综合法构建肛瘘术后创面大鼠模型[5-6],术前备皮,5% 戊巴比妥钠(戊巴比妥40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠,肛门部手术区备皮消毒,采用创伤制作器在脊柱旁侧0.5 cm处切割直径约为1.8 cm的圆形创口,且肌层伤口深度约为0.3 cm,止血后在创面上加粪液1 mL,固定(油纱、敷料、胶带),48 h后去除覆盖物,若见伤口有脓性分泌物与粪臭味出现,表示造模成功。将成功建立的20只肛瘘术后创面大鼠,根据随机数字表,按大鼠体质量随机分为模型组(n=10)及黛玉膏组(n=10);另选择10只仅造成创口后不敷以粪液作为对照组。黛玉膏组大鼠使用药物涂抹伤口,对照组和模型组以0.9%氯化钠溶液擦洗,纱布包扎伤口,每天2次。造模成功后当天开始治疗,各组大鼠均连续干预14 d,后以过量麻醉药注射处死,收集创面组织用以后续实验。

1.2.2创面愈合情况及局部血流监测:于第3天药物干预结束后,采用透明格子胶片测量局部创面面积,创面愈合率=【原始创面面积(术后3 d)-当前创面面积药物干预结束】/原始创面面积术后3 d×100%[7]。应用激光多普勒血流仪,所有大鼠均记录随机3处创面血流情况,并经Power Lab Chart数据采集分析系统计算3处创面血流取均值进行分析。

1.2.3HE染色:中性多聚甲醛固定创面组织,并用石蜡包埋,乙醇梯度脱水,二甲苯透明、浸蜡、包埋、切片。将切片进行粘片、烤片,脱蜡,梯度乙醇复水后进行抗原修复。用CD31抗体染色(1∶300)。封片后光学显微镜下观察阳性染色。

1.2.4ELISA操作步骤:取肛瘘创面组织匀浆检测VEGF、VEGFR、EGF、PDGF、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α水平,严格按照说明书操作,将标准品按照说明书操作方法梯度稀释后,另取待测样品孔加样50 μL并设空白孔,后于每孔加入酶标试剂50 μL(空白孔除外),封板膜封板并置37 ℃恒温箱温育60 min,每孔加满洗涤液静置15 s弃去,重复5次,先后加入显色剂A、B各50 μL,37 ℃避光显色15 min,加终止液 50 μL,450 nm 波长依序测量各孔的吸光度并进行浓度计算。

1.2.5Western blot法检测Nrf2及HO-1表达水平:采用Western blot法检测创面组织Nrf2及HO-1蛋白水平。使用RIPA高效组织裂解液提取总蛋白,BCA法测定蛋白浓度并加入5×SDS蛋白上样缓冲液(按1∶4的比例)煮沸后备用。每孔加入40 μg样品或3 μL Marker进行电泳,浓缩胶电压90 V,20 min,分离胶电压120 V,45 min,电泳后转膜,3%BSA(体积分数0.5%TBST)封闭1 h。孵育一抗,分别用Nrf2兔单克隆抗体(1∶1 500)、HO-1兔单克隆抗体(1∶1 500),β-actin兔单克隆抗体(1∶2 000),4 ℃孵育过夜,后以TBST洗3次。山羊抗兔IgG(1∶5 000)室温下孵育1 h后,TBST洗3次,每次5 min。ECL曝光显影,Image J图像处理软件分析结果。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠的创面愈合率比较

与对照组相比,模型组和黛玉膏组的创面愈合率显著下降(P<0.05);与模型组相比,黛玉膏组大鼠创面愈合率显著升高(P<0.05);与对照组比较,模型组和黛玉膏组显著下降,而黛玉膏组较模型组显著升高(P<0.05)(表1)。

表1 各组大鼠的创面恢复情况比较

2.2 各组大鼠创面CD31阳性率比较

CD31免疫组化染色结果显示(图1),与对照组比较,模型组肉芽组织CD31染色阳性面积显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,黛玉膏组大鼠肉芽组织,CD31染色阳性面积显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。

注:与对照组相比,*P<0.05;与模型组相比,#P<0.05

2.3 各组大鼠肉芽组织炎性因子水平比较

与对照组比较,模型组和黛玉膏组大鼠肉芽组织IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,黛玉膏组大鼠肉芽组织IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α水平均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 各组大鼠肉芽组织炎性因子水平比较

2.4 各组大鼠肉芽组织血管生成调控因子水平

与对照组比较,模型组肉芽组织VEGF、VEGFR、EGF、PDGF水平均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组和对照组相比,黛玉膏组大鼠肉芽组织VEGF、EGF、PDGF水平均显著增高,差异具有统计学意义(P<0.05);与模型组相比,黛玉膏组大鼠肉芽组织VEGFR显著增高(P<0.05),见表3。

表3 各组大鼠肉芽组织血管生成调控因子水平比较

2.5 各组大鼠创面组织Nrf2、HO-1蛋白的表达水平比较

与对照组相比,模型组的Nrf2、HO-1蛋白显著降低(P<0.05);与模型组和对照组相比,黛玉膏组大鼠创面组织Nrf2、HO-1蛋白的表达水平均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),见图2。

注:与对照组比较,#P<0.05;与模型组比较,*P<0.05

3 讨论

肛管直肠瘘,简称肛瘘,为肛管或直肠腔与肛门外皮肤相通的一种异常管道,中医亦称“痔漏”“漏疮”“单漏”[8]。瘘最早见于《素问·生气通天论篇》:“陷脉为瘘,留连肉腠”。《医宗金鉴·外科心法要诀·痔疮篇》释曰“破溃而出脓血,黄水浸淫,淋漓久不止者,为漏”。肛瘘一般由内口、瘘管和外口三部分组成,也有只有内口或外口者[9]。内口多为原发性,多数位于肛窦内。外口是继发的,在肛门周围皮肤上,口不只一个[10]。其特征为瘘管内口多位于肛窦内,管道穿过肛门直肠周同组织,外口位于肛周皮肤,经常有脓性分泌物由外口流出,每因外口闭合而致局部肿痛,继而在原外口处或附近重新溃破出脓,如此反复发作,经久不愈[11]。中医学将肛瘘的病因归纳为肛痈溃后、虚痨久咳、外感六淫、饮食不节、内伤七情、痔久不愈、肛周气血运行不足,而致毒邪集聚,最终穿肠透穴,败坏肌肉,消损骨髓,而为之瘘[12]。

黛玉膏针对肛瘘的病机而设,方由煅炉甘石、煅石膏、赤石脂、滑石、青黛、黄柏组成,其中煅炉甘石、煅石膏、滑石、赤石脂性平味甘,入肝、胃经,能够收湿敛疮,青黛、黄柏苦寒能够清热燥湿解毒;诸药相合,共奏燥湿解毒、拔腐生新之功[4]。以往的临床研究表明,黛玉膏外用能够减轻肛瘘患者术后创面的疼痛,促进创面愈合,其机制可能与增加创面 VEGF 表达、促进创面血管生成和成纤维细胞聚集有关[4]。VEGF 对血管内皮细胞的迁移、扩散、分化具有重要作用,是目前已知的作用最强的促血管生长因子,此外也能促进肉芽生长,加速上皮化[13]。CD31表达于血管内皮细胞,血小板等,是标记组织中血管的经典指标。研究通过建立大鼠肛瘘模型研究发现,使用综合法造模能成功建立肛瘘模型,而黛玉膏能够促进创面愈合、减轻创面病理损伤,抑制炎性因子表达而促进血管生成相关因子的表达,提高创伤部分血管数量和血流量。目前,关于黛玉膏发挥创面修复作用的基础研究较少,但关于其组分的药理作用已有报道。如煅石膏可以通过水通道蛋白(aquaporin,AQP)升高AQP1、AQP3的表达,促进急性软组织损伤的修复[14];炉甘石可以促进肉芽组织中的新生毛细血管生成,增加受损创面的血供,加速创面恢复[15];青黛能够促进皮损和黏膜创伤愈合,近期研究表明其能抑制皮损的炎性细胞浸润[16];减轻网络药理学分析表明,黄柏中的有效成分能够靶向炎性和血管新生通路相关分子治疗创面损伤[17]。以上数据表明使用综合法造模能成功建立肛瘘模型,而黛玉膏可能通过促进创面局部的血液循环、抑制炎性反应而加速肛瘘的好转。

创面愈合过程中,肉芽的生长速度和质量是愈合的关键[18]。为进一步探索其促进血管新生、增高血流量促进愈合的机制,本研究进一步检测了Nrf2/HO-1信号通路的表达水平。Nrf2转录调控因子,在细胞面对不良环境刺激时可被激活[19]。激活后Nrf2与内源性抑制因子 Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like ECH associated protein1,Keap1)结合,发生核转位并与抗氧化反应元件(antioxidant response element,ARE)结合,调控下游基因表达[20]。其中HO-1的启动子区富含ARE区域,是Nrf2下游最重要的基因之一[21]。HO-1是一种可将血红素降解产生胆绿素、亚铁离子和一氧化碳的水解酶,大量研究已经报道了HO-1在创伤愈合、肿瘤以及其他疾病中是重要的调控血管新生的因子[22]。如HO敲除小鼠表现出皮肤伤口愈合障碍及血管新生减少[23];类似的,使用小分子化合物抑制HO-1/CO信号可以显著降低血管新生水平[24]。另外,Nrf2/HO-1信号通路可以上调诸多血管新生因子的表达,如EGF、VEGF和 PDGF[25]。最后,有文献报道了Nrf2/HO-1与炎性因子的表达密切相关[26]。本研究结果显示,模型组大鼠创面组织的Nrf2及HO-1的水平较对照组显著降低,而涂抹黛玉膏后,Nrf2及HO-1的水平升高,表明其可以激活Nrf2/HO-1通路从而发挥促进血管新生的作用。

综上,本研究结果表明,黛玉膏可以促进肛瘘模型大鼠创面的愈合,促进肉芽组织的血管新生,其机制可能与激活Nrf2/HO-1通路有关。但血管新生涉及多条信号通路,因此黛玉膏的药理作用还有待进一步研究。