犬嗅辨人肺癌敏感性和特异性研究*

高常青 陈志恒 李晶晶 周 晓

(1.中南大学湘雅医院动物实验中心,长沙 410008)(2.中南大学湘雅三医院健康管理中心,长沙 410013)(3.湖南省肿瘤医院,长沙 410031)

犬能够嗅辨特殊人群或带瘤患者不仅是一个有趣的医学问题,更是一个关乎物种功能的生命科学问题,尽管不乏相关报道,但一直缺乏科学严谨的实验设计,可信度受到质疑。基于此,从典型癌症患者入手,科学、严谨地开展犬嗅辨能力测定,将有助于了解物种功能以及可能的早期癌症预警协助诊断。

恶性肿瘤是目前危害人类健康的主要疾病和掠夺人类生命的头号杀手,在2020年全球癌症统计报告解读中,肺癌是全球癌症致死的首位原因,占癌症致死总数的18%[1]。早诊断早治疗可明显改变肺癌患者的生存率[2],是治疗恶性肿瘤并获得良好预后的最重要手段。由于肿瘤早期基本上没有明显的症状和体征,所以目前大多数肿瘤确诊时都已到了中晚期。目前筛查早期肿瘤的方法尚不完善。例如,用CT等影像学方法筛查肺癌,不仅经济上不能承受,而且还会导致患者不必要的暴露于放射线。因此,建立一种新的既敏感又无创伤的筛查肺癌的方法是项极为紧迫的任务。

在传统的动物实验中,多是将药物给与实验动物,然后观察比较实验组与对照组动物的区别,或者通过转基因等手段造模后再在动物体内实验。但是,动物还有许多生物学功能没有充分开发利用,本研究的目的是通过检测经过训练的犬嗅辨人类肺癌的敏感性和特异性,尝试开发实验动物新的用途,达到充分利用实验动物生物学特性的目的。

1 对象和方法

1.1 参与对象

临床病理确诊为肺癌的患者25例,健康志愿者127例,作为实验对照。经签署知情同意书后,每人空腹抽血5毫升。收集的血样静置2 h后取血清冻存至-80 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1犬的训练:比利时牧羊犬2只,一雄一雌,自2月龄开始训练,饲养于中南大学实验动物学部,环境温度控制在20～26 ℃,湿度控制在40%～70%,采用12 h∶12 h昼夜间断照明。犬自由饮食,每天户外自由活动1 h以上。在犬0～3岁期间,实验人员A用食物刺激法与响片训练法进行严格训练,使得嗅辨犬具有良好的服从性,随后进行不同阶段的嗅辨训练。

1.2.2嗅认强化训练:在空旷安静且地面平坦的环境下,地面摆放形状大小一致且分别编码的嗅辨罐,嗅辨罐放置不同内容物(食物或玩具),实验人员A引导犬进行逐一嗅认,让犬养成自如的嗅认能力,犬每当嗅到一个目标物品时,给予响片刺激,并根据指令让犬完成规定动作,给予食物奖励。此过程需至少完成100次,且嗅辨准确性达到 90%以上,进行下一阶段训练。

1.2.3气味鉴别训练:在犬嗅认嗅源后,让犬嗅认随机摆放的鉴别罐,正确时响片标记。此过程需至少完成100次,嗅辨准确率达到90 %以上,进行下一阶段训练。

1.2.4单盲实验训练:每组设置6个嗅辨罐,其中1个为目标气味罐(肺癌患者血液样本),其余为阴性对照气味罐(健康志愿者血液样本),由实验人员B随机安排摆放位置并做好记录,实验人员A让犬依次逐个嗅认鉴别罐,当犬对某一嗅辨罐发出示警行为时,实验人员B给出正确与否示意,实验人员A根据示意给予响片确认。此过程需至少完成100次,且嗅辨准确率达到 90%以上,进行下一阶段实验。

1.2.5双盲实验:采用双盲法对犬的嗅辨准确性和特异性进行评价。实验人员C将匹配好的6个塑料袋密封标本(1个肺癌样本和5个健康志愿者样本)置于桌上并做好记录,用随机数字重新编号设盲。实验人员C将所有实验组记录信息保密,直到研究结束。实验人员B在对实验样本信息不知情的情况下,将随机编号的样本分别放进嗅辨罐中,并排成一条直线,由实验人员A示意犬依次嗅辨。当犬卧在某一罐前面即表明犬提示此罐中有阳性样本,由实验人员B记录结果。整个双盲实验过程中,实验人员A与实验人员B对阳性样本位置与编号均不知情。待所有实验完成后,由实验人员C将实验人员B记录的实验结果与设盲前的记录信息进行比较,计算出犬嗅辨的敏感性和特异性。敏感性超过90%的犬方可用于实验。

1.3 统计学分析

只有当2只犬都示警的标本才考虑为阳性标本,单只犬示警则仍记为阴性标本。敏感性=犬正确识别的肺癌患者样本数量/(犬正确识别的肺癌患者样本数量+犬误判为肺癌的健康志愿者样本数量)。特异性=犬正确识别的健康志愿者样本数量/(犬正确识别的健康志愿者样本数量+犬识别为肺癌的健康志愿者数量)。敏感性和特异性及阳性预测值和阴性预测值用MedCalc 19计算。

2 结果

2.1 参与者人口学资料

2014年5月至2015年12月,有200名肺癌患者,平均年龄(54.18±1.50)岁;1 000名健康志愿者,平均年龄(56.00±1.59)岁,贡献他们血液用于犬的训练。2016年1月采集127名健康志愿者血液进行双盲研究,平均年龄(55.10±1.44)岁,性别与肺癌患者匹配,经过5年的追踪未发现他们当时患有任何肿瘤。同时间段内,采集25名自愿者参与本研究的晚期肺癌患者血液,患者平均年龄(56.78±1.65)岁,肺癌分类如表1。

表1 肺癌患者临床资料分析

2.2 犬嗅辨双盲实验结果

25例肺癌患者全部嗅出,另有1名志愿者被2条嗅辨犬示警为阳性。经计算,犬嗅辨肺癌的敏感性为100%(95% CI:86.3%～100.0%);127名健康志愿者中126名准确嗅辨为阴性,特异性为99.2%(95% CI:95.7%～99.9%),阳性预测值(犬嗅辨为阳性的肺癌患者的比例)为96.2%(95% CI:78.0%～99.4%),阴性预测值(犬嗅辨为阴性的无肺癌参与者的比例)为100%,准确率99.3%。

3 讨论

研究表明,犬的嗅觉系统的特殊构造决定了其具有嗅辨人类癌症的潜能。与人类大约10 cm2的嗅觉上皮相比,犬的嗅觉上皮为170 cm2,是人类的17倍;犬的嗅觉受体超过2亿,是人类的40倍。犬的嗅觉受体受到更丰富的神经支配,加上鼻子的特殊构造,极便于它分辨吸进的气味[3]。本研究发现经过训练的犬,的确能够嗅辨肺癌,且准确率达99%以上。

国外自2004年开始系统研究犬嗅辨人类膀胱癌[4],近年陆续有报道用犬嗅辨人类疾病,如乳腺癌[5],宫颈癌[6]以及新冠病毒[7]等。本实验室从2011年开始训练犬嗅辨肺癌,经过多年努力,犬的工作性能已经稳定。本研究结果是训练3年的犬检测结果,与上述国外实验室的研究结果接近。

多项研究证明,参与者吸烟与否对犬嗅辨没有影响。近期有国内实验人员研究了犬嗅辨肺癌的影响因素[8],发现吸烟对犬嗅辨的结果没有显著影响。作者采用口罩采集参与者呼出气体,分别在病房环境和非病房环境采集样本,研究采样环境对结果的影响,发现与空白测试条件相比,医院环境能影响犬的嗅辨。但与对照组相比,医院环境对犬嗅辨没有显著影响。本研究采用血清作为鉴别介质,充分避免了环境因素的干扰。有研究[8]对照组的参与者都在30岁以内,Case-Control没有配对,实验没有排除年龄、性别的影响。而本研究采用了年龄与性别配对,避免了相关因素的干扰,将实验变量控制在了尽可能小的范围。

国外研究证明犬嗅辨早期和晚期肿瘤的能力是一致的[9]。因此,经过训练后的犬有可能成为筛查早期肿瘤的敏感工具。也正因为如此,我们对对照组的参与者观察5年后确定其在采样时为健康志愿者才进行报道,这样才最大可能的避免假阴性的发生(犬示某一志愿者为阳性,但当时的体检为阴性,但实际上该志愿者为早期肺癌;如果没有长期观察,很可能判定犬嗅辨结果为错误)。

大量事实证明,肿瘤具有多种生物标志物[10],包括挥发性生物标志物[11]。如肌氨酸可作为犬嗅辨前列腺癌的标志物[12],患者的尿液含有挥发性有机化合物可用于诊断各种癌症[13],而用于癌症诊断的挥发性有机化合物通常由多种物质组成[14]。在医疗工作中,当某些晚期肿瘤患者走近我们时,我们就能感觉到某种特有的气味,有经验的工作人员由此能做出初步判断。到目前为止,已有大量报道用顶空气相色谱—质谱联用(HS/GC-MS,Headspace/gas chromatography-mass spectrometry)或其他分析化学的方法能够检测出肿瘤患者体内所含的不同于正常人体内的成分。我国学者在2005年报导用HS/GC-MS测得肺癌患者血液中己醛(hexanal)和庚醛(heptanal)的含量明显高于正常人[15],有报道[16]称肺癌患者呼出气体中的乙醇、醛、酮和烃(hydrocarbons)显著高于正常人,而有研究[17]却发现丙烷、二硫化碳、异丙醇等的含量在正常人与肺癌患者呼出气体中含量有显著差别。类似的工作在细胞水平也进行了研究。有研究[18]比较正常肺细胞与肺癌细胞A549培养液顶空气体成分,发现肺癌组中二甲基琥珀酸等7项有机物成分比对照组显著增高。此外也有研究表明,不管是新鲜血液还是分解的血液样本,挥发性标志物均显示出特定化合物的差异[19]。

犬具有对恶性肿瘤的辨认能力的证据最初来源于它对主人恶性黑色素瘤的预警[20]。接下来的实验证明犬通过尿样辨认膀胱癌的概率高于完全随机的发生率[4]。进一步实验表明通过嗅辨患者呼出气体,犬能辨认肺癌、乳腺癌[6]及直肠癌[5],通过血浆能辨认卵巢癌[9]等。但是,这些研究都有一个共同不足,即对照组的参与者都没有经过长期观察,不知道采样时他们是否患有肿瘤。为了克服此缺点,本研究在采样及实验后,还对正常对照人群进行了5年跟踪观察确定是否患有肿瘤。这样设计虽然耗时较长,但结果更加可靠,在国内外未见报道。

实验动物是指经过人工培育,遗传背景清晰,微生物得到控制,用于检疫和科学实验等研究的动物[21]。本研究使用的嗅辨犬是由本实验室培育,其遗传背景清晰,饲养于实验动物设施内,定期进行微生物检测与驱虫预防,用于疾病的鉴别,属于实验动物的范畴。传统的利用实验动物进行检验检疫的方法,是将受试物饲喂或者接种于实验动物,然后观察比较实验组和对照组动物的差别。本研究是利用实验动物的生物学特性进行检验,拓展了实验动物的应用范围。本研究的局限性在于样本量仍然偏小,主要原因是在年龄、性别配对的要求下,很难收集到大量的志愿者样本。因此,本研究的结果有待大样本量的检验。

总之,实验动物的许多生物学特性尚未得到充分利用,实验动物的功能有待进一步开发。本研究是对实验动物应用的一个新的尝试。同时,建立一种新的既敏感又无创伤的筛查肺癌的方法对于我国经济社会具有重要的意义。而鉴定出肺癌挥发性标志物,对下一步训练新犬筛查早期肺癌,或对将来通过仪器检测挥发性标志物来筛查肺癌,都具有关键的作用。