自发性先天性白内障大鼠遗传状况分析*

尤金炜 梁 磊 张旭亮 吴正林 董 敏 田小芸

(东部战区总医院医疗保障中心实验动物室,南京 210002)

自发性先天性白内障(TSC)大鼠是东部战区总医院实验动物室2007年在SD大鼠繁殖生产时发现的5只先天性白内障大鼠为基础培育的近交系大鼠,经过10多年的连续近交繁殖,现已39代,暂定名为TSC大鼠,我们已经对TSC大鼠的生长繁殖性能、生理生化指标、晶状体病理学等做了详细的分析,且根据国家标准[1]对其进行了皮肤移植以及生化标记分析遗传质量的研究[2],该大鼠符合近交系质量标准规定。

下颌骨形态具有高度的遗传稳定性,它们的形态和出现的变异可以作为动物突变或变异的标志,被广泛用于实验动物生物学研究及品系间的鉴定[3]。

微卫星(microsatellite),又被称作短串连重复(short tandem repeats, STRs)或简单重复序列(simple sequence repeats, SSRs),每单元长度在1～6 bp,是均匀分布于真核生物基因组中的一类分子标记,在不同的近交系动物之间存在核心序列或重复次数变化[4],国内外研究均证明微卫星标记应用于实验动物的遗传质量检测,具有可靠性[5-7]。

为了保证此品系大鼠的遗传稳定性和可靠性,本研究同时应用下颌骨形态学分析和微卫星DNA分析方法对其遗传质量进行进一步分析,并与常用近交系BN大鼠和F344大鼠进行比较,以积累TSC大鼠的遗传学数据,为该品系的遗传学标准建立积累数据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物:TSC大鼠由本实验室提供,生产许可证号【SCXK(军)2017-0018】;BN大鼠、F344大鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司,生产许可证号【SCXK(沪)2018-0006】,大鼠各30只,均为6～8周龄,体质量170～200 g,雌雄各半。所有动物均在SPF级设施饲养,使用许可证号【SYXK(军)2017-0037】,并按使用的3 R原则给予人道的关怀。

1.1.2主要仪器与试剂:电泳仪(天能EPS-100),凝胶图像处理系统(天能3500R),基因扩增仪(天隆-DTC)。DNA分子质量Marker(索莱宝),琼脂糖(OXOID),Taq酶(诺唯赞),DNA提取试剂盒(天根),其他试剂为国产或进口分析纯。

1.1.3引物选择:根据文献报道,选择近交系大鼠常用的6个微卫星位点:D3Wox9、APOC3、D11Mgh3、D12Mit2、RATIL6G和PA2S。所有引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1下颌骨形态分析:参照文献[8]建立的方法,利用11个变异函数,1～6 为高度测量点,7～11 为长度测量点,均为右侧下颌骨。拍照后利用 PhotoshopCS5分析获得数据。

1.2.2微卫星DNA检测

1.2.2.1鼠尾DNA提取:灭菌剪刀剪取鼠尾约30 mg,剪碎处理为细胞悬液,根据试剂盒步骤提取DNA备用。

1.2.2.2PCR扩增:反应体系为25 μL,Mix 12.5 μL,上游引物和下游引物各1 μL,模板DNA 1 μL,用超纯水补足 25 μL。扩增条件:94 ℃预变性3 min,94 ℃变性 15 s,55 ℃复性 15 s,72 ℃延伸 15 s,共循环35 次。

1.2.2.3扩增产物鉴定:2.5% 琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物,30 min。凝胶图像处理系统成像后,根据是否有稳定的条带以及在凝胶上的泳动距离判断结果,如果泳动距离一致,则表现为单态性;若泳动距离有差异,则表现为多态性。

2 结果

2.1 下颌骨形态分析

经方差分析,TSC大鼠、BN大鼠、F344大鼠11项下颌骨变量测量结果见表1,TSC大鼠与BN大鼠相比较,下颌骨参数有9个差异有统计学意义(P<0.01);TSC大鼠与F344大鼠相比较,下颌骨参数有5个差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 微卫星位点的引物和泳动距离

所选6个微卫星位点,在2.5% 琼脂糖凝胶上均有稳定的条带,采用泳动距离为标准进行判读,“a、b、c……”表示不同的距离,其中a表示距离最长,依次为a、b、c……。详见表2。

表2 6个微卫星引物序列及泳动距离(n=2)

结果显示,同一品系不同个体之间在同一位点扩增产物的条带完全相同,表现为单态性,泳动距离一致,详见图1,2;在不同品系之间表现为多态性,详见图3,4。其中位点PA2S、RATIL6G、D11Mgh3、APOC3可以将TSC与BN大鼠区别;位点D3Wox9、D12Mit2、PA2S、D11Mgh3可以将TSC与F344大鼠区别;D11Mgh3一个位点就可以将3种大鼠完全区别。

注:M:DNA marker;1～8.TSC大鼠

注:M:DNA marker;1～8.TSC大鼠

注:M.DNA marker;1～6.PA2S位点,7～12.RATIL6G位点;1、2、7、8.TSC,3、4、9、10.BN,5、6、11、12.F344

注:M.DNA marker;1～6.D12Mit2位点,7～12.D3Wox9位点,13～18.APOC3位点;1、2、7、8、13、14.TSC,3、4、9、10、15、16.BN,5、6、11、12、17、18.F344

3 讨论

实验动物在生命科学研究中被公认是不可缺少的“活的精密仪器”,而实验动物的遗传状况对动物实验的结果有着非常大的影响。但是实验动物在生产、繁殖、应用过程中,常会造成实验动物遗传物质的改变,进而影响实验数据的准确性。所以实验动物遗传质量监测是实验动物标准化管理一个极其重要的内容,是确保实验动物品系纯度和同一性的重要手段。

下颌骨形态是遗传力很高的性状,由某些多态性位点决定,具有品系特征,一般环境因素对下颌骨形态几乎没有影响,是一种很好的定量分析技术,下颌骨分析属于表型检测,也是国标中近交系动物遗传检测方法之一。

微卫星 DNA有着基因位点多、多态性高、扩增片段短的特点,同样在近交系动物中微卫星的长度一般不会变化,可以作为某一品系的恒定参数,不同品系则可能存在差异,因此微卫星DNA的检测在实验动物遗传检测和品系鉴定中具有非常重要的价值。

近年来,利用微卫星进行遗传检测的报道很多,有研究[9]分析了国内6个品系、8个近交系大鼠群体;有研究[10]选取了87个微卫星标记,对 6 种近交系大鼠进行遗传检测;还有研究[11]建立了大鼠 24 个微卫星位点库,优选出 6 个微卫星位点,可用于3 种常用近交系大鼠的监测;同时也有研究[6]就实验小鼠、大鼠微卫星DNA检测法标准的编制进行了详细的阐述。

本研究结合下颌骨测量和微卫星检测,对TSC大鼠进行遗传分析。结果表明,TSC大鼠、BN大鼠、F344大鼠11项下颌骨变量测量结果与TSC大鼠和BN大鼠相比较,X1-X7、X10-X11差异极显著(P<0.01);TSC大鼠与F344大鼠相比较,X1、X3-X5、X7差异极显著(P<0.01)。采用的6个微卫星位点,结果显示同一品系不同个体之间在同一位点扩增产物的条带完全相同,表现为单态性,微卫星位点均为纯合,符合近交系动物的遗传质量标准。在不同品系之间表现为多态性,6个微卫星位点的组合可用于TSC大鼠与常用近交系大鼠品系BN和F344的遗传背景监测,4个位点可以将TSC大鼠与BN大鼠区别,4个位点可以将TSC大鼠与F344大鼠区别,组合后均可区分3种大鼠,其中D11mgh3一个位点就可以将3个品系大鼠完全区别。

生物医学的发展离不开实验动物,实验动物发展的基础是遗传质量控制,随着现代生物技术高速发展,检测手段和检测仪器在不断的进步,分子生物学技术被广泛的运用到检测中。微卫星作为第二代遗传检测技术,其优点是操作简便,重复性好,无需安乐死实验动物,只需剪小段尾巴提取 DNA 进行检测,符合动物福利和3R原则,主要应用于近交系动物的遗传分析,但尚未形成国家标准,本研究测定的TSC大鼠和常用近交系大鼠品系BN、F344的6个微卫星位点,为大鼠遗传监测工作提供了有益的参考,也积累了TSC大鼠的遗传学数据和监测方法,为该品系大鼠的深入研究及应用推广建立了较为系统的原始资料。