啮齿类实验动物唐菖蒲伯克霍尔德菌荧光定量PCR方法的建立及应用

申屠芬琴 刘 敏 王雪妹 王吉星 彭 刚 吴石爱 李艳楠 周 倩 张巧稚 韩 雪

(北京维通利华实验动物技术有限公司,北京 100107)

唐菖蒲伯克霍尔德菌(B.gladioli)是一种植物病原菌,属革兰阴性杆状细菌,条件性致病菌。这种菌广泛存在于土壤、水和植物中[1]。主要危害是污染食品产生毒素,导致食物中毒[2-3],在实验动物上的报道较少。2004年有文献[4]报道了B.gladioli引起的免疫缺陷鼠中耳炎暴发,2019年有文献[1]报道了因B.gladioli污染饮用水导致免疫缺陷小鼠头部倾斜。感染了唐菖蒲伯克霍尔德菌的免疫缺陷鼠通常引发中耳炎,临床表现为头部倾斜、被抓住尾巴时盘旋等,大体病变主要为耳道内产生脓性物质[4]。GB 4789.29—2020描述了对食品中唐菖蒲伯克霍尔德菌的培养和鉴定方法,但步骤多耗时长。因此,建立和使用唐菖蒲伯克霍尔德菌荧光PCR检测方法,对唐菖蒲伯克霍尔德菌进行快速检测和鉴定,满足实验动物质量检测的需求非常必要。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1主要试剂:唐菖蒲伯克霍尔德菌(编号10574)(CICC);金黄色葡萄球菌(编号26003-505)和绿脓杆菌(编号10107-3)(中国食品药品检定研究院);产酸克雷伯杆菌(编号700324)和嗜肺巴斯德杆菌(编号13669)(ATCC);肺炎克雷伯杆菌(编号46108-5)(CMCC)。110只SPF小鼠,为国内不同设施送检,包含BALB/C、FVB、C57BL/6N、BALB/c Nude、NOD SCID、NU NU、NOG等品系。唐菖蒲伯克霍尔德菌引物、探针和质粒,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。MagMAXTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit和TaqManTMGene Expression Master Mix(ABI公司)。

1.1.2主要仪器:7500荧光定量PCR仪(ABI公司);KingFisher全自动核酸提取仪(ThermoFisher公司);Heal fore2级生物安全柜(力康生物医疗科技控股有限公司)。

1.2 方法

1.2.1引物、探针和质粒的合成:参考团标T/SATA 023—2021《唐菖蒲伯克霍尔德氏菌及米酵菌酸产毒株检测方法实时荧光PCR 法》序列(表1),由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 唐菖蒲引物和探针序列

1.2.2质粒标准品的制备:用无核酸酶水溶解合成的唐菖蒲伯克霍尔德菌质粒干粉,并按1∶10稀释成1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和1×101copies/5 μL,编号为S1～S7。

1.2.3荧光PCR体系的建立:将提取的DNA作为模板,进行荧光PCR扩增检测。反应体系为:唐菖蒲伯克霍尔德菌上游引物、下游引物和探针各1 μL,Master Mix 10 μL,无核酸酶水2 μL,提取的DNA模板5 μL,合计共20 μL。反应程序:第一阶段 50 ℃ 2 min,95 ℃ 10 min;第二阶段 95 ℃ 15 s,60 ℃ 1 min,40个循环;60 ℃采集信号。

1.2.4线性实验:检测S1～S7 7个浓度梯度的线性化质粒DNA标准品,绘制标准曲线,要求线性相关系数R2≥0.99。

1.2.5灵敏度和重复性实验:检测S1～S7 7个浓度梯度的线性化质粒DNA标准品,每个浓度做3个重复,统计结果,检验方法灵敏度和重复性。

1.2.6特异性实验:将唐菖蒲伯克霍尔德菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯杆菌、绿脓杆菌和嗜肺巴斯德杆菌等6个菌株进行复苏和培养,挑取单菌落,加入200 μL PBS 混匀。使用KingFisher全自动核酸提取仪提取核酸作为模板,用本方法进行检测,检验方法特异性。

1.2.7本方法的结果判定:Ct值≥40,可判定样品结果为阴性;Ct值≤35,可判定样品结果为阳性;35< Ct值<40,为样本疑似,需将样品重新检测。若重测的结果Ct值≥40则判为阴性,否则判为阳性。

1.2.8本方法的应用及与细菌培养法的比对:将送检的110只活体小鼠进行安乐死后采集口咽部样品,同时用本方法以及GB 4789.29—2020细菌培养法进行检测,比较两种方法检测结果。

2 结果

2.1 线性实验结果

在反应孔中分别加入S1～S7 7个样本及配置好的PCR混合液,进行扩增反应。以基因的Ct值为纵坐标,样本浓度为横坐标,绘制标准曲线(图1),线性相关系数R2=0.998,本方法线性良好。

图1 标准曲线

2.2 灵敏度和重复性实验结果

将S1～S7 7个浓度梯度的线性化质粒DNA标准品重复检测3次,扩增曲线见图2。质粒DNA浓度1×107～1×102copies/5 μL(S1～S6)均为阳性,即方法灵敏度可达1×102copies/5 μL。计算每个浓度重复检测的CV值(表1),可见各浓度重复3孔CV值<2%,方法重复性良好。

图2 质粒DNA标准品扩增曲线

2.3 特异性实验结果

用本方法同时检测培养的唐菖蒲伯克霍尔德菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯杆菌、产酸克雷伯杆菌、绿脓杆菌和嗜肺巴斯德杆菌的菌液。结果除唐菖蒲伯克霍尔德菌外,其余菌液均为阴性。扩增曲线见图3,仅唐菖蒲伯克霍尔德菌阳性菌株有明显扩增,方法特异性良好。

图3 特异性实验

2.4 本方法的应用及与细菌培养方法的比对结果

采集110只活体小鼠口咽部样品,用本方法检测,结果110份样品及阴性对照均没有扩增,阳性对照有明显扩增(图4)。同时用细菌培养法对此110份小鼠样品进行检测,结果为阴性。2种方法检测结果完全符合。

3 讨论

唐菖蒲伯克霍尔德菌是一种条件致病菌,致病因素包括免疫抑制和/或补体缺乏[4]。随着科技的发展,免疫缺陷鼠被越来越多的用于现代生物医学研究,这类实验动物对唐菖蒲伯克霍尔德菌易感,感染后引起中耳炎暴发,对科学研究造成干扰和损失。建立检测唐菖蒲伯克霍尔德菌的方法,可满足生产商和使用者对于实验动物质量在这方面的需求。

在食品领域,对于唐菖蒲伯克霍尔德菌已建立了多种鉴定方法,如培养法和VITEK生理生化鉴定、MALDI-TOF-MS和recA序列分析法、实时荧光PCR检测技术等[5-7],可供实验动物领域借鉴。培养法是最经典的方法,但所需时间长;质谱方法鉴定耗时短且准确性高,但仪器价格昂贵;分子生物学方法准确性好,检测时间短,价格远低于质谱法,从适用性和实效性来说更适合用于实验动物的检测。

本文建立的荧光PCR方法线性良好,线性相关系数R2=0.998;灵敏度高,最低可检测到1×102copies/5 μL;重复性好,CV<2%;特异性强,除唐菖蒲伯克霍尔德菌外其他几种菌均为阴性。方法各项性能良好,实际送检样品检测结果与培养法一致,可用于实验动物唐菖蒲伯克霍尔德菌的检测,为实验动物的质量监测提供了技术支持。