卵黄高磷蛋白磷酸肽在Caco-2 细胞单层模型中的促钙转运作用

李松明，赵梦蝶，刘 伟，马美湖，金永国，黄 茜*

（1 华中农业大学食品科学技术学院蛋品加工技术国家地方联合工程中心农业农村部蛋品加工重点实验室 武汉 430070 2 宜宾林竹产业研究院 四川宜宾 644000）

钙是人体主要的二价阳离子，约占人体体重的1.5%～2.2%。体内大部分（99%）的钙沉积在骨骼和牙齿中，然而，钙也以离子形式存在于软组织、细胞外液和血液中。钙不仅是肌肉收缩和放松、神经传递、免疫反应的细胞内信使，而且能保持细胞增殖、血清和骨钙含量之间的动态平衡[1]。钙缺乏可能导致代谢性骨病，如佝偻病和骨质疏松症。研究人员发现，氨基酸可与钙结合，形成氨基酸络合钙，其吸收快、吸收率高，价格低，具有可同时提供氨基酸和钙的优点[2]。近年来的研究表明，相比氨基酸螯合钙，肽螯合钙具有更易被吸收且吸收速率更快的特点，这是因为其独特的螯合机制和转运机制，同时多肽本身具有特殊生物活性[3-4]。因此，具有促钙吸收生物活性功能的肽钙复合物有很好的应用前景和发展空间。

传统观念认为钙仅以离子形式被吸收，它必须被溶解或从它的来源中释放出来。然而，一些溶解的钙会在小肠的碱性pH 值中与矿物质或其它膳食成分如草酸和植酸形成不溶性复合物，导致钙吸收和利用不足。近年来研究发现，酪蛋白磷酸肽（CPPs）能结合钙离子形成可溶性肽-钙复合物，促进钙吸收和在骨中的积累[5]。CPP 可以促进钙吸收的Caco-2 细胞调控的TRPV6 表达，关于钙离子在肠道内的吸收转运机制主要有两种：主动跨细胞转运机制和被动旁细胞转运机制[6]。在鸡蛋蛋黄中同样存在一种高磷酸化的蛋白——卵黄高磷蛋白（PV），它是自然界中磷酸化程度最高的蛋白[7]。PV 中可以被磷酸化的丝氨酸和苏氨酸残基几乎都被磷酸化，许多丝氨酸残基排列成最多15个连续残基。虽然目前所有的商业磷酸肽都是用酪蛋白制备的，但是PV 具有更高的磷酸化水平，是比酪蛋白更好的磷酸肽制备来源。然而，由于PV 具有很强的负电荷，阻碍了蛋白酶进入裂解位点[8]。最近，本课题组开发了一种高温中压（HTMP，121 ℃，0.1 MPa）预处理技术，在不损失PV 中磷酸基团的情况下，提高了卵黄高磷蛋白的酶解程度，可释放出更丰富的磷酸肽片段（PPP）[9]。

目前，关于PPP 促钙吸收转运的活性研究鲜有报道。本研究目的是采用复合酶解的方法处理PV 得到水溶性多肽PPP，优化肽结合钙的制备条件，探究肽钙螯合物的酸碱稳定性。采用Caco-2单层细胞模型，依据细胞钙转运量、AKP 活性和CalbindinD9K mRNA 的相对表达量来评估PPPCa 的体外促钙吸收特性。研究结果旨在利用鸡蛋中的活性肽作为功能性营养补充剂提供参考。

1 材料方法

1.1 材料与试剂

采用Lei[10]的方法制备卵黄高磷蛋白。人结直肠腺癌细胞（Caco-2 cells），由武汉普诺赛生命科技有限公司提供，碱性蛋白酶（alkaline phosphatase，AKP）活性检测试剂盒，南京建成生物工程研究所；胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶，美国Enzyme Co.Ltd（Elgin,IL,USA）；MTT、DMEM 培养基、MEM 培养基、二甲基亚砜、PBS 缓冲液、0.25%胰酶（含0.02% EDTA）、青霉素-链霉素，美国Hyclone 公司；胎牛血清（FBS），澳洲GIBCO 公司。

1.2 主要仪器和设备

酶标仪，联想生物科技有限公司；JSM-6390LV 扫描电镜，日本NTC 公司；HERAcell 1501 二氧化碳培养箱，德国Thermo Scientific 公司；IX71 荧光倒置显微镜，日本Olympus 公司；DL-CJ-2ND 超净工作台，哈尔滨东联电子技术开发有限公司；Millicell-ERS 电阻仪，美国Millicell公司；XB-K-16 血球计数板，上海安信光学仪器公司；HH-4 数显电子恒温水浴锅，巩义市予华仪器有限责任公司；TDL-50B 台式低速离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 卵黄高磷蛋白磷酸肽的制备 PPP 是按照Ji 等[11]的方法制备的，并进行了一些修改。PV 进行HPMP 预处理，预处理的温度、压力和时间条件为121 ℃、0.1 MPa、30 min，然后用胰蛋白酶和嗜热菌蛋白酶依次对HTMP 预处理的卵黄高磷蛋白进一步水解，制备PPP。两次酶解结束后都将样品在沸水浴中保存10 min，以终止酶解得到PPP。酶解溶液冻干并保存在-20 ℃的冰箱中直到使用。

1.3.2 肽-钙螯合物制备及其优化 将酶解得到的PPP 溶于去离子水（10 mg/mL）中，加入CaCl2制备肽钙螯合物。

肽钙质量比：设定螯合反应条件，pH 7.0，温度40 ℃，反应时间30 min，设定不同肽钙质量比为5∶1，6∶1，7∶1，8∶1，9∶1，10 ∶1，以钙结合率确定最佳肽钙质量比。

反应pH 值：设定螯合反应条件，肽钙比1∶1，温度40 ℃，反应时间30 min，设定不同pH 值，以钙结合率为指标确定最佳反应pH 值。

反应温度：设定螯合反应条件，肽钙比1 ∶1，pH 7.0，反应时间30 min，设定不同温度为室温，30，40，50，60 ℃，以钙结合率为指标确定最佳反应温度。

反应时间：设定螯合反应条件，肽钙比1 ∶1，pH 7.0，温度40 ℃，设定不同反应时间为5，15，30，45，60，75 min，以钙结合率为指标确定最佳反应时间。

1.3.3 肽钙螯合物的胃肠稳定性分析 模拟消化稳定性：胃部消化，将肽钙复合物配制成质量浓度为2 mg/mL 的溶液，用1 mol/L HCl 调pH 2.0，加入2%胃蛋白酶37 ℃水浴消化0.5，1，1.5，2，2.5 h后取出一部分消化液，100 ℃水浴灭酶10 min，9倍体积无水乙醇沉淀后离心，原子吸收测定上清液钙含量，计算胃部消化后PPP 的钙结合量。

小肠消化：胃部消化后，用1 mol/L NaOH 调节pH 7.5，加入胰蛋白酶37 ℃水浴消化0.5，1，1.5，2，2.5 h 后取出一部分消化液，100 ℃水浴灭酶10 min，9 倍体积无水乙醇沉淀后离心，原子吸收测定上清液钙含量，计算小肠消化后PPP 的钙结合量。

稳定性用钙储留率表示：

式中：Ca后——消化后的钙含量；Ca前——消化前的钙含量。

1.3.4 Caco-2 细胞培养及单层模型制备 Caco-2 细胞复苏是将细胞冻存管迅速从液氮罐中转移至37 ℃水浴锅中，融化后用吸管吸出细胞悬液加适量完全培养基，混匀后离心（1 000 r/min，3 min）。弃去上清液，加入含有20% FBS 的完全DMEM 培养基重悬细胞，接种到25 cm2的细胞培养瓶中，于37 ℃CO2培养箱中静置培养，次日更换培养基。

待培养瓶中的细胞融合到80%以上，用PBS清洗3 遍细胞，胰酶消化5～8 min，添加适量培养基终止消化，离心（1 000 r/min，3 min）得到细胞，添加新鲜完全培养基（89% DMEM、10% 胎牛血清、1%双抗）并吹打均匀，按照1∶2 或者1∶3 的比例传代培养，隔天换液，3～4 d 进行传代，复苏以后的细胞传代3 次后细胞活力上升，调整细胞密度约 1×105cells/mL，每孔0.5 mL 接种于TranswellTM 12 板上室（AP 侧），下室（BL 侧）添加1.5 mL 完全培养基于培养箱中培养。接种细胞后前1周，每隔1 d 更换新鲜培养液，之后每天换液。培养到约21 d，细胞分化成致密单层细胞，可以用于科学试验。

1.3.5 不同浓度多肽及肽钙螯合物对Caco-2 细胞毒性的影响 试验分为6 组：①空白组：培养液+MTT 溶液；②对照组：培养液+MTT 溶液+细胞；③给药组1：PV+培养液+MTT 溶液+细胞；④给药组2：HTMP-PV+培养液+MTT 溶液+细胞；⑤给药组3：PPP+培养液+MTT 溶液+细胞；⑥给药组4：PPP-CaCl2+培养液+MTT 溶液+细胞。

取对数生长期的3×104～5×104个/mL 的细胞悬浊液100 μL 放入96 孔培养板中培育24 h，细胞贴壁后换液，分别加入含有不同质量浓度的样品（0，50，100，200，300，400，500 μg/mL）的培养基100 μL。培养24 h 结束后，每孔加入含有0.5 mg/mL 的MTT 的无血清培养液MEM 200 μL，继续培养4 h 后，每孔加入150 μL DMSO，室温下摇床振荡10 min，充分混匀并溶解蓝紫色的甲臜颗粒。在酶标仪上选择570 nm 波长，测定各孔吸光度值。试验重复3 次，取平均值。按以下公式计算：

式中：As——试验组吸光度值；Ac——对照组吸光度值；Ab——空白组吸光度值。

1.3.6 Caco-2 细胞单层模型的建立 钙转运试验采用单层细胞模型[12]。将处于生长对数期的Caco-2 细胞消化后，以1×105个/mL 的密度接种到12 孔TranswellTM 培养板上。TranswellTM 培养板上室（AP 侧）添加0.5 mL 细胞培养基，随后在下室（BL 侧）加入1.5 mL 完全培养基，每组设置3个平行。细胞接种后隔天换液，7 d 后每天换液，培养至21～27 d，细胞形成致密单层可以用于后续试验。

1.3.7 Caco-2 细胞单层跨上皮电阻 Caco-2 细胞单层模型建立的整个过程都需要监控TEER 值的变化情况，为研究药物渗透性提供依据。将MilicellERS-2 型细胞电阻仪的电极两端分别放置于TranswellTM 培养板中AP 侧小室和BL 侧小室测定电阻值。其计算公式为：

其中12 孔TranswellTM 培养板中支持膜面积为1.12 cm2。

1.3.8 碱性磷酸酶活性试验 碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）是肠上皮细胞刷状缘的标志酶，能反映肠上皮细胞分化程度及其功能状态。细胞TEER 值大于200 Ω·cm2后，每隔2 d 分别取AP 侧与BL 侧中培养基，根据碱性磷酸酶试剂盒的方法测定AKP 活性。

1.3.9 Caco-2 细胞单层通透性验证 荧光黄标准曲线的制备：用荧光分光光度计测定不同质量浓度（0.5，0.75，1，1.25，1.5，1.75 μg/mL），以荧光强度为纵坐标，浓度为横坐标进行线性回归，求得标准曲线。

向AP 侧加入0.5 mL 荧光黄溶液（5 μg/mL），BL 侧加1.5 mL HBSS，将培养板放置在37 ℃恒温摇床上培养0，30，60，90，120 min，分别从BL 侧取0.5 mL 样品液，再向BL 侧加入0.5 mL 预热HBSS。在试验结束时，用荧光光度计测定样品液荧光强度，依据以下公式计算表观渗透系数Papp。

式中：dQ/dt——单位时间荧光黄转运量，mg/s；A——转运膜表面积；C0——培养液中荧光黄原始质量浓度，μg/mL。

1.3.10 Caco-2 细胞单层形态观察 将Caco-2细胞接种在12 孔TransWellTM 培养板中培养21 d，细胞用PBS 清洗后用戊二醛固定，脱水处理后临界点干燥喷金，生物扫描电子显微镜下观察。

1.3.11 钙转运试验 钙离子不同浓度梯度转运试验：配制不同浓度的CaCl2溶液（0.5，1，2，4 mg/mL），溶于HBSS 缓冲溶液中后37 ℃水浴）。Caco-2 单层模型建立21 d 后，将12 孔TransWellTM 板上下室清洗3 遍后，下室加1.5 mL 预热的HBSS（无钙），上室加入0.5 mL 的CaCl2溶液，3 h 后取下室溶液，原子吸收光谱法测定其钙含量。

肽钙复合物转运试验：操作如钙离子转运试验，清洗后，下室加入1.5 mL 预热的HBSS，上室加入0.5 mL 的肽钙复合物，3 h 后取下室溶液，原子吸收光谱法测定其钙含量。

1.3.12 TRPV6 钙离子通路中CalbindinD9K m RNA 相对表达量 在建模21 d 后，用含有（PV、HTMP、PPP、PPP-Ca）的完全培养基处理24 h 后，HBSS 清洗3 遍。用裂解液收集细胞，RT-PCR 测定CalbindinD9K m RNA 的相对表达量。

2 结果与讨论

2.1 磷酸肽螯合钙制备条件优化

肽与钙的质量比是影响多肽与金属离子螯合的最主要因素。肽与钙的比率过高会导致肽利用率降低，过低则会导致反应形成的络合物稳定性差[13]。Wu 等[14]发现猪骨胶原肽与钙的质量比为4.5∶1 时，钙结合率为78.38%。

图1a 显示，随着PPP 与Ca2+的质量比的增大，钙螯合率显著增加（P＜0.05），在质量比为7 ∶1时，钙螯合率达到97%，质量比继续增大钙螯合率稳定。pH 值对钙螯合率的影响如图1b 所示。由图可知，随着反应体系pH 值的增大，钙螯合率变化明显。当底物的pH 值从5.5 增加到9.5 时，钙螯合率显著增加（P＜0.05）。钙结合率显著上升可能是因为反应体系中的氢离子减少，因此有更少的氢离子与钙离子竞争结合磷酸基团，有利于钙结合到磷酸肽表面。因此，螯合反应的最佳pH 值为9.5。已有研究发现，卵黄高磷蛋白的金属结合速率较快，在较短时间内就可以结合金属离子[15]。图1c、1d 结果显示，反应温度和螯合时间对肽钙结合率没有显著影响。

图1 螯合条件对钙螯合率的影响Fig.1 The effect of chelating conditions on the calcium chelating rate

2.2 模拟胃肠道消化稳定性

膳食成分被机体吸收利用需要经胃消化后在肠道被吸收，因此依据物质对胃蛋白酶、胰蛋白酶的耐受性可模拟评价其在消化过程中的稳定性[16]。食物在体内的消化过程中，一般经过胃的时间是0.5～3.0 h，经过肠道的时间是2.0～2.75 h。如图2 所示，肽钙复合物经胃蛋白酶作用时，随时间的延长，其钙解离率增大。当胃蛋白酶酶解2.5 h时，其钙解离率为36.31%。这可能是因为模拟胃部消化体系的pH 值为2.0，结合pH 值对PPP-Ca稳定性结果可知，酸性条件下肽钙复合物的稳定性降低，解离出钙离子，因此钙解离率较高[17]。复合物的最终钙保留率为63.69%，说明胃蛋白酶对PPP-Ca 的作用不大，仅对pH 值较为敏感。加入胰蛋白酶调节pH 值到7.5，模拟肠液消化2.5 h 时，肽钙复合物的钙解离率为7.25%。钙保留率为92.75%。结果表明，肽钙复合物对胰蛋白酶的消化不敏感，在胰蛋白酶酶解过程中，反应体系pH 值为中性，由肽钙复合物的酸碱稳定性试验结果可得，肽钙复合物可在此pH 值条件下保持稳定[18]。

图2 模拟胃肠道消化对肽钙复合物稳定性的影响Fig.2 The effects of simulated gastrointestinal digestion on the stability of peptide-calcium complexes

2.3 Caco-2 细胞毒性试验

采用MTT 法测定PV、HTMP-PV、PPP 和PPP-Ca 对于Caco-2 细胞的毒性作用，试验结果如图3 所示，PV、HTMP-PV、PPP、PPP-Ca 的浓度在0～400 μg/mL 范围内，Caco-2 细胞经样品处理24 h 后，细胞活性均能保持在80%以上。说明4 种样品对Caco-2 细胞均不具有较大的毒性作用，可做后续试验[19]。

图3 不同浓度PV（a）、HTMP-PV（b）、PPP（c）和PPP-Ca（d）对Caco-2 细胞的细胞毒性作用Fig.3 Cytotoxic effects of PV（a），HTMP-PV（b），PPP（c）and PPP-Ca（d）at different concentrations on cultured Caco-2 cells

2.4 Caco-2 细胞单层模型TEER 值

在接种Caco-2 细胞于TransWellTW 板上后，每2 d 测定细胞单层跨膜电阻值（Transepithelial electrical resistance,TEER）。由图4 可知，TEER值在建模7 d 内增加稍缓，这是由于Caco-2 细胞刚开始贴壁，细胞分裂尚未达到融合[20]。而当Caco-2 细胞开始融合，从第10 天起TEER 值开始急剧增加，在第14 天达到860 Ω·cm-2，此后保持相对稳定状态。据文献报道当TEER 值大于250 Ω·cm-2时，表明Caco-2 细胞形成了致密的单层膜结构，可以用于药物的转运试验研究[21]。

图4 Caco-2 细胞单层模型的跨膜电阻（TEER）与建模时间的关系Fig.4 The transepithelial electrical resistance（TEER）of Caco-2 cells monolayer model in relation to modeling time

2.5 Caco-2 细胞单层模型碱性磷酸酶（AKP）活性

碱性磷酸酶是Caco-2 细胞单层模型建立过程中分泌的标志性酶。主要在细胞单层的刷状缘部位表达，并反映细胞单层膜的极化状况[21]。若AP 侧AKP 活性显著高于BL 侧，则说明Caco-2细胞单层膜极化情况较好。如表1 所示，在第10天时，AP 侧和BL 侧AKP 活力比为1.06，说明细胞极化程度还未达到要求，此时的TEER 值也较低（图4）。随着培养时间的延长，AKP 活性呈上升趋势，在第21 天时，AP/BL 酶活力比达到3.39，表明Caco-2 细胞单层模型极化基本完成，可以用于药物转运试验。

表1 不同培养时间Caco-2 细胞单层膜两侧碱性磷酸酶活性变化情况Table 1 The changes of alkaline phosphatase activity on both sides of the monolayer of Caco-2 cells at different culture times

2.6 Caco-2 细胞单层模型通透性试验

如表2，在培养21 d 后，测定Caco-2 细胞单层膜荧光黄通透性。根据公式计算出添加荧光黄溶液于上室后，每30 min 后取下室溶液测定荧光黄荧光强度。结果表明，Caco-2 细胞在TranswellTM 板中培养21 d 后，荧光黄的渗透率在120 min 能达到（7.79±0.12）×10-6cm/s，表明已经形成了完整的单细胞层[22]。

表2 不同处理时间Caco-2 细胞单层模型的荧光黄通透性Table 2 Fluorescence yellow permeability of Caco-2 cell monolayer model at different treatment times

2.7 Caco-2 细胞单层模型形态

在Caco-2 细胞接种于TranswellTM 板上培养21 d 后，用戊二醛进行固定，临界点喷金干燥后在生物扫描电镜下观察。结果如图5 所示，可以观察到清晰致密的微绒毛结构，这说明Caco-2 细胞已经形成了单层膜，并且分化出了单层膜的形态学特征，可用于药物转运试验。

图5 培养21 d 后Caco-2 细胞单层细胞的SEM 图Fig.5 SEM image of monolayer cells of Caco-2 cells after 21 days of culture

2.8 钙转运试验

由图6 可知，在建模21 d 后，在上室中加入不同浓度的CaCl2溶液0.5 mL，3 h 后测定下室中的钙离子含量，发现随着钙离子浓度的增大，下室中钙的转运量增大，并呈现一定的剂量依赖性。说明Caco-2 单层细胞模型建立成功，具有转运药物的能力。进一步由图7 发现，在上室加入钙离子100 μg 的CaCl2、PV+CaCl2、HTMP-PV+CaCl2和PPP-CaCl2，3 h 后测定下室钙含量，CaCl2的钙转运量为3.06 μg，PV+CaCl2、HTMP-PV+CaCl2和PPP-CaCl2的钙转运量分别为4.09 μg、5.33 μg 和5.66 μg。结果表明PPP-CaCl2可明显提高钙转运量，且高于无机钙CaCl2组。这也与有些文献结果一致，例如，13 ku 葵花籽肽（SSP4）和10 ku 花生肽（PP1）的钙复合物组分在Caco-2 细胞单层膜中的钙转运量显著高于CaCl2组[23]。

图6 不同钙离子浓度的钙转运量Fig.6 Calcium transports at different calcium ion concentrations

2.9 TRPV6 钙离子通路相关蛋白mRNA 的表达

钙离子在肠道内的吸收转运机制主要有两种，主动跨细胞转运机制（如TRPV6 钙离子通道、Cav3.1 钙离子通道等）和被动旁细胞转运机制。Caco-2 主要表达的是TRPV6 钙离子通道，通过测定TRPV6 钙离子转运通路中的CalbindinD9K 蛋白基因表达情况可以得出其钙离子转运能力。由图8 发现用PPP-CaCl2处理24 h 后，PV-CaCl2组的CalbindinD9K m RNA 表达量与对照组没有显著差异（P＞0.05）。HTMP-PV 和PPP-Ca 组的CalbindinD9K m RNA 的相对表达量明显上调（P＜0.05），其中PPP-Ca 组达到2.22，是对照组的2 倍多。表明肽钙复合物可通过上调CalbindinD9K m RNA 的表达，增加钙的转运量[24]。

图8 PV-Ca、HTMP-PV-Ca、PPP-Ca 和CaCl2对Caco-2 单层细胞TRPV6 钙离子通路基因CalbindinD9K 表达水平RT-PCR 分析Fig.8 RT-PCR analysis of PV-Ca,HTMP-PV-Ca，PPP-Ca and CaCl2 on the calbindinD9K of TRPV6 Ca2+ pathway genes expression level of Caco-2 monolayer cells

3 结论

本试验首先优化了PPP-Ca 螯合的最佳条件，结果显示在pH 值为9.5，多肽与钙质量比7∶1的条件下，钙螯合率达到97%，PPP-Ca 在模拟胃肠道消化中显示了极高的稳定性。在Caco-2 细胞单层模型中，用MTT 法验证了PV、HTMP-PV、PPP-Ca 对Caco-2 细胞的无毒性作用，在建模21 d 后检测细胞的钙离子转运量，结果表明：PV+CaCl2、HTMP-PV+CaCl2和PPP-Ca 均可以增加钙转运量与CaCl2组相比，其中PPP-Ca 组的钙转运量最高，达到（5.66±0.62）μg。同样在Caco-2 细胞单层试验中，在探究CalbindinD9K mRNA 表达情况时，发现PPP-Ca 可以上调CalbindinD9K mRNA 的表达，从而增加钙的转运量。

本试验对PPP 的跨Caco-2 细胞膜转运吸收机制进行研究，便于筛选出生物利用度高的促钙吸收肽和其结构特征，为这些肽提高生物利用度并起到更好补钙的作用提供可能。但是PPP 在Caco-2 细胞单层膜中的具体转运通路机制可能需要通过抑制通路表达来进一步验证。