酸面团发酵煎饼对2 型糖尿病小鼠的影响

唐天培，黄自伟，张娜娜，闫博文*，赵建新，张 灏，陈 卫，范大明

（1 江南大学食品学院 江苏无锡 214122 2 泰安市强德食品有限公司 山东泰安 271000）

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，主要分为1 型糖尿病（type 1 diabetes，T1D）、2型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）和妊娠期糖尿病（gestational diabetes mellitus，GDM）[1]。其中2 型糖尿病是最常见的糖尿病类型，占到所有糖尿病病例的90%以上。目前，对2 型糖尿病的临床治疗主要使用双胍类、磺脲类、噻唑烷酮类和糖苷酶抑制剂等药物[2]。此外，饮食控制也是治疗2 型糖尿病的重要环节。以杂粮谷物制品为代表的低升糖指数（GI）食品能有效减缓餐后血糖的迅速上升，调节胰岛素反应，近年来受到越来越多的关注。

山东煎饼作为我国北方地区的传统主食之一，主要由玉米、小米、高粱等杂粮制成。山东煎饼的制作过程虽较为简单但极需技巧，将谷物原料浸泡一段时间后，研磨成面糊，经发酵或不发酵，在鏊子上用刮板快速均匀地摊制成薄薄的圆饼[3]。高温、短时、低水分接触的加工方式使得山东煎饼的淀粉糊化度显著低于馒头、干饭、粥等其它主食。淀粉糊化度越低，进食后消化吸收速度越慢，有利于减缓餐后血糖反应[4]。因此，山东煎饼因独特的加工方式和杂粮谷物原料而被认为是适合糖尿病患者食用的主食。

酸面团是由谷物和水的混合物经有活性的微生物（如酵母菌和乳酸菌）发酵后的产物，又被称为“酵子”或“老面”，在米面食品的加工中通常被当作“引子”以促进米面食品的发酵[5]。酸面团技术不仅可以改善食品的质构和风味，也能赋予食品一定的功能特性。有研究表明，用乳酸菌酸面团发酵小麦和黑麦粉可以降低全麦面包的淀粉消化率[6]，这可能与酸面团发酵能降低淀粉糊化度相关。此外，在酸面团发酵过程中，乳酸菌通过糖基水解酶的催化合成大量的有机酸和胞外多糖。有机酸尤其是乳酸能降低淀粉消化率，乙酸和丙酸能延迟胃排空时间[7]。很多研究报道了多糖对糖尿病的缓解作用，主要集中在植物多糖如燕麦多糖、枸杞多糖和桑叶多糖等，而关于乳酸菌胞外多糖对糖尿病影响的研究较少。部分体外试验表明，乳酸菌胞外多糖具有潜在的降血糖活性[8]。也有研究指出植物乳杆菌X1 的无细胞上清液通过抑制α葡萄糖苷酶活性显示出潜在的抗糖尿病能力[9]。为了充分了解植物乳杆菌酸面团发酵对山东煎饼抗糖尿病特性的影响，需进行体内试验。

本研究以高脂饮食结合链脲佐菌素诱导的T2D 小鼠为试验对象，研究植物乳杆菌发酵酸面团山东煎饼对T2D 小鼠体重、血糖、胰岛素抵抗、血脂、胰腺组织、短链脂肪酸水平及肠道菌群等方面的影响，为开发适合糖尿病患者的功能性主食提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米：购自中国无锡欧尚超市。

试剂：链脲佐菌素（STZ），美国Sigma 公司；60%高脂饲料，南通特洛菲饲料科技有限公司；二甲双胍，阿拉丁试剂有限公司；蔗糖、牛肉膏、葡萄糖、酵母粉、乙酸钠、柠檬酸氢二铵、磷酸氢二钾、硫酸镁、吐温80、无水乙醇、乙醚、浓硫酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸，国药集团化学试剂有限公司；胰岛素检测试剂盒，南京森贝伽生物科技有限公司；总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）试剂盒，南京建成生物工程研究所；PCR扩增引物及合成序列，上海生工生物工程有限公司；FastDNA Spin Kit for Feces 粪便基因组提取试剂盒，美国MP 公司；QIAquick Gel Extraction Kit 胶纯化回收试剂盒，德国Qiagen 公司。

1.2 仪器与设备

恒温恒湿培养箱，上海森信实验仪器有限公司；胶体磨，河北廊坊科技有限公司；罗氏活力型血糖仪和血糖试纸，美国罗氏有限公司；MLS-3750 高压蒸汽灭菌锅，日本Sanyo 公司；5415R 型台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf 公司；SWCJ-1FD 型超净工作台，上海智诚科技有限公司；Leica ASP300S 型全自动脱水机、Leica RM2245型半自动切片机，德国LEICA 公司；Pannoramic MIDI 型组织切片扫描仪，匈牙利3D Histech Kft公司；1300-ISQ 型Thermo/Trace GC-MS、3020 型多功能酶标仪，美国Thermo 公司；PE300 型MiSeq高通量测序平台，美国Illumina 公司；2100 型Agilent（安捷伦）生物分析仪，美国Agilent 科技有限公司。

1.3 菌悬液的制备

植物乳杆菌X1 因其高产胞外多糖的特性和潜在的降血糖能力[9-10]被选择用来发酵酸面团，其由江南大学食品生物技术中心菌种库提供。菌株通过划线分离，挑取单菌落于液体MRS 培养基中，于37 ℃条件下培养18 h，再按2%接种量在液体MRS 培养基中37 ℃二代培养18 h。然后接种于液体MRS 培养基中37 ℃培养24 h 进行扩培。将扩培好的植物乳杆菌X1 在4 ℃，6 000 r/min 条件下离心10 min，所得菌泥用无菌水通过菌落计数方法调整活菌量在109CFU/mL 得到菌悬液，用于接下来的酸面团发酵。

1.4 酸面团发酵及山东煎饼的制备

将玉米按1∶1.2（质量比）浸泡在水中6 h，然后用胶体磨研磨成玉米面糊。将上述菌悬液加入面糊中混匀达到最终浓度108CFU/g，然后37 ℃发酵12 h 获得酸面团（pH 3.72±0.10，1010CFU/g）。

未发酵山东煎饼是用100%未发酵玉米面糊在鏊子上摊制而成（140 ℃，40 s）。发酵山东煎饼是用80.0%的未发酵玉米面糊和20.0%的酸面团混合均匀后在鏊子上摊制而成（140 ℃，40 s）。

1.5 动物实验方案设计

所有动物实验的操作均严格遵守江南大学动物管理和使用委员会的章程（SYXK 2012-0002）。动物实验的伦理审核号为 JN.No20210615c0600922[189]。60 只C57BL/6J 小鼠（SPF 级，雄性，3 周龄）购自北京维通利华实验动物技术有限公司。适应性喂养1 周后，随机分为空白组（8 只）饲喂正常小鼠饲料和糖尿病造模组（52 只）饲喂60%高脂饲料。4 周高脂饲料喂养后糖尿病组52 只小鼠禁食不禁水12 h，腹腔注射STZ 溶液（100 mg/kg 体重，溶于0.1 mol/L 柠檬酸盐缓冲液，pH 4.5），同时空白组小鼠注射柠檬酸盐缓冲液。继续高脂饲料喂养1 周后，测定空腹血糖（FBG），FBG＞11.1 mmol/L 即为造模成功[11]。

将造模成功的32 只T2D 小鼠随机分成4组，每组8 只，分别是模型组（MC）、阳性对照组（PC）、未发酵煎饼组（NFP）和发酵煎饼组（FP）。空白组（NC）为正常小鼠始终饲喂标准饲料，模型组（MC）为T2D 小鼠饲喂标准饲料，阳性对照组（PC）为T2D 小鼠饲喂标准饲料同时每天灌胃二甲双胍（200 mg/kg 体重），未发酵煎饼组（NFP）和发酵煎饼组（FP）为T2D 小鼠分别饲喂未发酵山东煎饼和发酵山东煎饼制成的饲料（煎饼样品冻干后由江苏协同生物有限公司按73%的对应样品加27%的标准饲料制成棒状饲料）。干预持续6周，小鼠可以自由获得食物和水。每周禁食12 h后记录体重。实验结束前，用2 mL 灭菌干燥EP 管收集新鲜粪便样本，立即冰上放置，并迅速转移到-80 ℃的冰箱中。小鼠禁食不禁水12 h 后腹腔注射戊巴比妥钠溶液麻醉（0.5 mL/10 g 体重），摘除眼球取血后颈椎脱臼处死。血液在4 ℃，3 000 r/min 离心15 min，收集血清保存在-80 ℃冰箱中。胰腺组织用4 ℃预冷的生理盐水漂洗后固定在4%多聚甲醛溶液中。

1.6 空腹血糖、胰岛素和胰岛素抵抗指数的检测

每周一小鼠禁食不禁水12 h 后采用尾部取血方式，使用罗氏血糖仪检测空腹血糖值。

胰岛素水平的检测采用胰岛素检测试剂盒，检测方法按照说明书进行。

胰岛素抵抗指数按下列公式计算：

胰岛素抵抗指数=（空腹胰岛素含量×空腹血糖值）/22.5

1.7 血脂分析

总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDLC）水平使用试剂盒测定。

1.8 胰腺组织病理学分析

用4%多聚甲醛溶液固定的胰腺组织经过夜洗涤后，脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、染色。观察并拍摄组织具有代表性的显微照片。

1.9 粪便短链脂肪酸含量的测定

小鼠粪便冻干后称取约50 mg 粪便样品加入0.5 mL 饱和NaCl 溶液，再用20 μL H2SO4溶液酸化后加入1 mL 乙醚旋涡萃取，混合物12 000 r/min 离心15 min 并脱水后得到上层乙醚相，用气质联用仪（GC-MS）仪器测定乙酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸的含量。

1.10 肠道菌群的测定

小鼠粪便中细菌基因组的提取按照Fast DNA Spin 试剂盒说明书进行。对细菌16S rDNA的V4 区进行PCR 扩增，扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，电压120 V，30 min。按照胶回收试剂盒的说明书进行V4 区PCR 产物的胶回收。按等质量浓度原则混样并用MiSeq 测序仪上机测序。获得下机数据地址后，利用SSH Secure Shell Client 软件进行数据提取和合并。去除嵌合体序列，进行OTU 聚类，选取OTU 代表性序列以进行后续分析。通过对序列进行分类，制定biom 格式的OTU 表。根据otu_table.biom 进行α、β 多样性和肠道菌群门属水平种类与丰度的分析。

1.11 统计分析

试验数据以平均值±标准差表示，用SPSS 的单因素ANOVA 和邓肯式多重比较对各组数据的差异进行分析，不同字母标注代表具有显著差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 空腹体重

小鼠空腹体重的变化如图1a 所示。在6 周的干预过程中，空白组小鼠的体重不断增加，而所有T2D 小鼠均出现体重减轻的典型病理特征[17]。阳性组小鼠从第2 周开始，体重开始回升并保持相对稳定，说明二甲双胍能缓解T2D 小鼠的体重快速下降。发酵煎饼组小鼠体重下降的幅度低于模型组和未发酵煎饼组，但这3 组小鼠的体重之间没有显著性差异（P＞0.05）。

图1 饮食干预期间小鼠空腹体重（a）和空腹血糖（b）水平的变化Fig.1 Changes in fasting body weight（a）and fasting blood glucose（b）levels of mice during the dietary intervention

2.2 空腹血糖

空腹血糖是T2D 最常规的检测指标，能够反映患者糖代谢情况及胰岛β 细胞功能状态[12]。由图1b 可知，在干预开始前，T2D 小鼠的空腹血糖值均明显高于空白组小鼠（P＜0.05）。6 周的干预过程中，空白组小鼠空腹血糖值始终正常且稳定，而模型组和未发酵煎饼组小鼠空腹血糖值始终保持上升趋势。发酵煎饼组小鼠的空腹血糖值在干预后期（4～6 周）上升趋势逐渐减缓甚至开始下降，表明发酵煎饼具有一定的降血糖作用。有研究表明，有活性的和经过高温处理杀死的乳酸菌均表现出一定程度的降低T2D 小鼠空腹血糖和餐后血糖的能力[13]。因此，发酵煎饼组观察到的小鼠空腹血糖的下降可能与死菌和酸面团发酵过程中高产的胞外多糖等发酵产物有关，即使在煎饼加工过程中高温杀死了绝大多数的活菌。

2.3 胰岛素和胰岛素抵抗

胰岛素是由胰腺β 细胞分泌的一种参与血糖调节的蛋白质激素。胰岛素抵抗是T2D 典型的特征，主要表现为胰岛素敏感性下降，胰岛素过度积累却没有发挥降血糖的作用[14]。如图2a 和2b 所示，模型组小鼠的胰岛素水平和胰岛素抵抗指数均显著高于空白组（P＜0.05），表明模型组小鼠出现了严重的胰岛素抵抗。与模型组和未发酵煎饼组相比，发酵煎饼组小鼠的胰岛素抵抗指数显著降低（P＜0.05），表明发酵煎饼的干预在一定程度上可以改善T2D 小鼠的胰岛素抵抗。有研究报道过，灌胃植物乳杆菌K68 发酵的果蔬汁比单纯灌胃植物乳杆菌K68 或果蔬汁更能降低糖尿病大鼠的胰岛素抵抗[15]。植物乳杆菌发酵果蔬汁过程中额外产生的胞外多糖可能是发酵果蔬汁更能改善胰岛素抵抗的原因，这与我们观察到的试验结果相一致。

图2 发酵煎饼对小鼠胰岛素水平（a）和胰岛素抵抗（b）的影响Fig.2 Effect of FP on insulin level（a）and homeostasis model assessment of insulin resistance（b）in mice

2.4 血脂

血脂异常也是T2D 的常见特征，通常通过血清TC、TG、HDL-C 和LDL-C 来表征。由表1 可知，相比于空白组，模型组小鼠的血脂异常主要表现为TC、TG 和LDL-C 的显著升高（P＜0.05），而HDL-C 显著降低（P＜0.05）[9]。与模型组相比，发酵煎饼组小鼠的LDL-C 水平没有显著性差异（P＞0.05），但TC 和TG 水平显著降低（P＜0.05），HDLC 水平显著升高（P＜0.05），表明长期饲喂发酵煎饼虽然没有达到全面调节T2D 小鼠血脂4 项的效果，但在一定程度上改善了血脂异常的状态。

表1 发酵煎饼对小鼠血脂的影响Table 1 Effect of FP on levels of serum lipids in mice

2.5 胰腺组织病理学分析

胰岛损伤是高脂饮食和STZ 诱导T2D 小鼠模型的一个重要组织学特征。在模拟T2D 模型中，胰岛细胞的损伤主要是由STZ 引起的[16]。各组小鼠胰腺组织切片HE 染色结果如图3 所示。空白组小鼠胰岛呈规则的圆形或近圆形，轮廓清晰，胰岛细胞数目丰富，形态饱满且排列整齐[17]。而模型组小鼠的胰岛受到了严重的损伤，胰岛体积变小，结构皱缩，分布较松散，胰岛细胞数量减少，细胞空泡化现象严重。阳性药物二甲双胍对T2D 小鼠的胰岛萎缩有明显的缓解作用。与模型组和未发酵煎饼组相比，发酵煎饼组小鼠胰岛受损情况得到了一定程度的改善，胰岛大小显著恢复，胰岛细胞数量显著增加。此外，胰岛的形态和结构也趋向于完整[16，18]。

图3 发酵煎饼对小鼠胰腺组织的影响（放大倍数，400×）Fig.3 Effect of FP on the pancreas in mice（magnification，400×）

2.6 短链脂肪酸

短链脂肪酸是未消化的淀粉和纤维经过厌氧微生物发酵的主要产物，包括乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸和戊酸等，在调节肠道健康、保护肠道微生态平衡方面发挥着重要的作用[16]。不同干预组小鼠粪便中短链脂肪酸的水平如图4 所示，模型组小鼠5 种短链脂肪酸的水平都低于空白组，这与Wang 等[17]报道的结果相一致。与模型组相比，未发酵煎饼组的丙酸、丁酸水平显著升高（P＜0.05），这可能与玉米作为煎饼的原料粗纤维含量较高相关。发酵煎饼组5 种短链脂肪酸的水平均高于未发酵煎饼组和模型组，尤其是异丁酸和戊酸表现出显著性的差异（P＜0.05）。有研究表明，补充植物乳杆菌NCU116 发酵胡萝卜汁的大鼠粪便中短链脂肪酸水平显著高于补充未发酵胡萝卜汁[18]。类似于发酵胡萝卜汁体系，植物乳杆菌发酵酸面团过程中同样产生大量胞外多糖，这些多糖在肠道内经过厌氧微生物发酵产生一定量的短链脂肪酸因而导致了我们观察到的结果。据报道，乙酸可以降低食欲，抑制体内脂肪堆积[17]。丙酸可以降低胆固醇和甘油三酯水平，提高胰岛素敏感性，从而改善葡萄糖代谢[19]。补充丁酸可以缓解小鼠的胰岛素抵抗并增加能量消耗。此外，丁酸已被证明能激活胚胎干细胞中调节胰腺早期发育的基因，从而增加胰腺β 细胞的分化和胰岛素相关基因的表达[20]。因此，可以推测，酸面团发酵煎饼能改善T2D 小鼠糖脂代谢紊乱，进一步缓解胰岛素抵抗，可能是通过调控短链脂肪酸水平实现的。

图4 发酵煎饼对小鼠粪便短链脂肪酸含量的影响Fig.4 Effect of FP on fecal short-chain fatty acids content in mice

2.7 肠道菌群

T2D 的发生发展与肠道菌群有着密切的联系，饮食对肠道菌群结构的形成也起着至关重要的作用，不同饮食干预对T2D 小鼠肠道菌群α 多样性的影响如图5 所示，包括Shannon，Evenness，Faith_pd 和Observed_otus。相比于模型组，发酵煎饼组的Shannon 指数和Observed_otus 均有上升，表明长期饲喂发酵煎饼可以提高T2D 小鼠肠道菌群的多样性和丰富度。为了更直观地了解不同干预组小鼠肠道菌群组成的差异情况，我们对各组样本的所有分类水平结果进行了主坐标成分（PCoA）分析如图6 所示。空白组和模型组完全分开，没有重叠，说明高脂饮食和STZ 注射造模导致模型组小鼠的肠道菌群结构发生了显著变化。未发酵煎饼的干预对T2D 小鼠的菌群结构产生一定的影响，但没有显著差异。发酵煎饼组与阳性组产生较大重叠，即其肠道菌群表现出与阳性组较大的相似性，且其与未发酵煎饼组和模型组的差异显著，表明发酵煎饼干预在一定程度上改善了小鼠肠道菌群多样性，这可能有助于缓解糖尿病[21]。

图5 发酵煎饼对α 多样性指数的影响Fig.5 Effect of FP on α diversity index

图6 发酵煎饼对β 多样性的影响Fig.6 Effect of FP on β diversity

图7 显示了各组在门水平上的相对丰度，小鼠的肠道微生物主要由厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）组成。与之前的报道一致[17]，相比于空白组，模型组小鼠肠道微生物中厚壁菌门相对丰度上升，拟杆菌门相对丰度下降，厚壁菌门/拟杆菌门的值升高，变形菌门相对丰度增加。厚壁菌门/拟杆菌门的值已被证明与血糖水平呈正相关[22]。与模型组相比，发酵煎饼组的小鼠厚壁菌门相对丰度下降，拟杆菌门相对丰度上升，厚壁菌门/拟杆菌门的值降低，这与发酵煎饼组小鼠观察到的较低的血糖水平相符合。

图7 不同组别小鼠肠道菌群门水平变化Fig.7 Changes at phylum level of mice fecal microbiota in different groups

图8a 显示了各组在属水平上的相对丰度。为明确饮食干预对小鼠属水平上的肠道菌群造成的影响，采用LEfSe 对不同组小鼠的肠道菌群进行差异性分析（设定LDA 值大于4），结果如图8b 所示。阳性组的标记菌属为拟杆菌属，拟杆菌属是重要的短链脂肪酸产生菌[23]，许多证据表明机体肠道微生物自发形成的短链脂肪酸对宿主健康具有十分重要的作用，二甲双胍缓解T2D 的良好作用可能与其提高产短链脂肪酸菌群的丰度密切相关。未发酵煎饼组的标记菌属为粪杆菌属和副沙门氏菌属，发酵煎饼组的标记菌属为乳杆菌属和脱硫弧菌属。据报道，乳杆菌属丰度的增加可促进胰岛素的分泌，在T2D 患者中乳杆菌属的比例与血糖水平呈负相关[23]。此外，乳杆菌属能增强胆汁水解酶的活性，增加粪便中脂类的排泄，减少脂类堆积[24]，这与本研究中观察到的发酵煎饼组小鼠血脂的改善相符合。因此，乳杆菌属可能是调节T2D 小鼠血糖水平，缓解血脂异常的靶向菌之一。Yan 等[11]也报道过嗜酸乳杆菌干预导致T2D 小鼠脱硫弧菌属丰度的增加，脱硫弧菌属是人体肠道中主要的硫酸盐还原菌，虽然有研究推测脱硫弧菌属与肠道疾病有关，但二者之间的关系尚存争议。属水平上不同组之间具体的菌群差异如图8c～8f 所示，除乳杆菌属和脱硫弧菌属外，与模型组和未发酵煎饼组相比，发酵煎饼组中的苏黎世杆菌属和黏液螺旋菌属的相对丰度也显著升高（P＜0.05）。苏黎世杆菌属被报道与肠道丁酸水平相关，而丁酸盐的增加与胰岛素敏感性的改善有关[25-26]。黏液螺旋菌属也属于短链脂肪酸产生菌，有研究认为黏液螺旋菌属，粪球菌属，拟杆菌属和副杆菌属等短链脂肪酸产生菌通过肠道菌群-短链脂肪酸-炎症通路缓解胰岛素抵抗，进一步改善糖代谢[17，27]。此外，Galle 等[8]报道过酸面团来源的胞外多糖能刺激结肠碳水化合物发酵产生短链脂肪酸，并增加肠道菌群的数量。因此，我们认为植物乳杆菌发酵酸面团过程中产生的发酵产物，如有机酸和胞外多糖等，是饲喂发酵煎饼能显著改变T2D 小鼠肠道菌群结构，增加乳杆菌属和产短链脂肪酸菌属苏黎世杆菌属及黏液螺旋菌属的丰度，并进一步影响其病理生理指标的主要原因。

图8 不同组别小鼠肠道菌群属水平变化Fig.8 Changes at genus level of mice fecal microbiota in different groups

3 结论

本试验研究了植物乳杆菌发酵酸面团山东煎饼对T2D 小鼠的缓解作用。6 周的发酵煎饼干预可以降低T2D 小鼠空腹血糖水平和胰岛素抵抗、改善血脂异常、保护胰岛功能、调节SCFA 水平和肠道菌群。酸面团发酵过程中产生的发酵产物如有机酸和胞外多糖等，可能是发酵煎饼表现出显著的抗糖尿病作用的原因。以上结果表明，植物乳杆菌发酵酸面团山东煎饼有望成为T2D 患者的功能性主食。