体外模拟消化对核桃主成分代谢及抗氧化特性的影响

李 夏，陈杭君，夏 魏，郑永华，金 鹏，牛 犇，房祥军，吴伟杰，3*，郜海燕*

（1 浙江省农业科学院食品科学研究所 农业农村部果品采后处理重点实验室浙江省果蔬保鲜与加工技术研究重点实验室 中国轻工业果蔬保鲜与加工重点实验室 杭州 310002 2 南京农业大学食品科技学院 南京 210095 3 省部共建农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室 杭州 310021）

核桃（Juglans regia L.）和扁桃、腰果、榛子三者合称为“四大干果”[1]。核桃富含人体所需的脂肪酸、蛋白质、多酚类、糖类、黄酮类及多种微量元素与膳食纤维等[2-3]。核桃中油脂质量分数为52%～70%，且油脂以不饱和脂肪酸为主，约占82%～85%，蛋白占比24%左右，富含多种必需氨基酸[4]。核桃是人体优质的营养物质来源，具有健脑益智，延缓细胞衰老以及增强免疫力的功效，并对心血管疾病也有一定的辅助功效[5-6]。目前对核桃营养价值的开发和功能活性的研究还不够深入，对核桃的消化代谢及活性研究较少，导致其产品创新研发受阻[7]。在核桃产品的生产加工中，还存在未能充分利用的营养成分，造成营养浪费的现象。如何全面开发利用核桃的营养价值也成为产业营养健康发展的聚焦点[8]。

体外消化系统是在体外条件下模拟体内消化吸收情况，以达到还原人体胃肠道生理过程的目的[9]。它可以完全或部分替代活体试验，具有成本较低、耗时短、可重复性强等优点[10]。在研究膳食消化时，最常用的是多酶系多腔室静态模型，其主要优势之一是固定模拟消化食物的条件，并尽量保证消化模型的统一[11]。此方法可用于分析消化产物和评估食物基质中微量元素的释放，以此来评估食物消化至终点或某时间点时的情况[12]。

食物消化过程中的pH 值及各种消化酶类对食物的抗氧化特性有一定影响，营养成分提取物的功能活性与消化后的实际利用情况存在差异。韩海涛等[13]发现在相同质量浓度下，核桃蛋白中的清蛋白对DPPH 自由基清除能力最高，其次为醇溶蛋白，均高于二丁基羟基甲苯（Butylated Hydroxyl Toluene）。这与其氨基酸组成、分子质量和结构有关，因此能有效抗衰老和防御多种心脑血管疾病[14]。核桃多肽也具有一定抗氧化能力，并具有一定的量效关系[15]。弘子姗等[16]用酶解法提取核桃多肽，当多肽质量浓度0.5 g/mL 时，其DPPH 清除率87%，ABTS+清除率84%，羟基自由基清除率82%，铁离子还原能力达45%，说明核桃多肽具有一定的抗氧化能力[17]。

由于核桃油中含有较多的多不饱和脂肪酸，因此易发生氧化变质[18]，使核桃油产品货架期缩短。核桃油的抗氧化能力还可用来评价油脂的品质特性[19]。彭星星等[20]研究表明，核桃油含有多种生物活性物质，如黄酮、生育酚、甾醇等，具有较强的抗氧化能力，然而，核桃油中的天然活性物质会随时间呈现急剧减少的变化特征，对自由基的清除能力逐渐降低，抗氧化能力也降低。

本文以“新新2”核桃为研究对象，提取油脂和蛋白质两类主成分进行相关研究。采用GC-MS和HPLC-MS/MS 分析核桃消化过程中油脂和蛋白质含量的变化，体外消化特性及消化产物的抗氧化活性，旨在为研发核桃油内源性天然抗氧化剂，核桃产品的开发提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

核桃品种为 “新新2” 核桃（Juglans regia‘Xinxin 2’）（原产地新疆），购于洽洽食品股份有限公司。胰脂肪酶、胰酶、胰蛋白酶、猪胆盐，阿拉丁生化科技有限公司；三氯乙酸、过硫酸钾、铁氯化钾、三氯化铁、硫酸铜、酒石酸钾，分析纯，阿拉丁生化科技有限公司；福林酚，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；游离脂肪酸含量试剂盒，科铭生物技术有限公司；氨基酸含量测定试剂盒，仑昌硕生物有限公司；DPPH 自由基清除试剂盒，南京建成科技有限公司；甲醇、正己烷、异丙醇，色谱纯，CNW Technologies GmbH；乙腈，色谱纯，德国默克集团；D35-氘代硬脂酸，纯度为98%，德国默克集团；三甲基硅烷基重氮甲烷，在正己烷中含量为2moL/L，上海麦克林生化科技有限公司。

1.2 设备与仪器

LR56495 台式离心机，赛默飞世尔科技公司；THZ-C-1 恒温冷冻振荡器，海门其林贝尔仪器制造有限公司；DK-8D 电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；LC20AD-API 3200MD TRAP HPLC-MS/MS，日本岛津公司；7890B 气相色谱，安捷伦科技有限公司；ReadMax1900 酶标仪，上海闪普生物科技；UV-9000 紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 核桃油脂和蛋白的提取 参考闫圣坤等[21]的方法，采用冷榨法提取核桃油脂，设置温度170℃榨取核桃油。参考刘猛等[22]的方法，采用酸沉碱提法分离纯化核桃蛋白质，将核桃粕与蒸馏水按质量比1∶25 混合，用氢氧化钠调节pH 值为9，碱提；用盐酸调节pH 值为5，酸沉。

1.3.2 模拟体外消化试验方法 试验分组：设置蛋白质组即Pr 组（样品只含核桃蛋白）、7∶3 组（样品中核桃蛋白质与油脂质量比7∶3）、1∶1 组（样品中核桃蛋白质与油脂质量比1∶1）、3∶7 组（样品中核桃蛋白质与油脂质量比3∶7）、油脂组即Oil 组（样品只含有核桃油）。

模拟胃消化阶段：称取3.10 g 氯化钠、1.10 g氯化钾、0.30 g 二水氯化钙、0.60 g 碳酸氢钠溶解在1 L 蒸馏水中，配成胃电解质溶液。配制1 mol/L乙酸钠溶液并调节pH=5。所有溶液预热至37 ℃。取17 样品、255 mL 胃电解质、59.50 mg 胃蛋白酶、0.51 mL 乙酸钠溶液于锥形瓶中，用1 mol/L 盐酸调节pH 值至2～3，37 ℃，80 r/min 摇床温育2 h。分别于20，40，120，140，160，180 min 和240 min处取样，90 ℃水浴灭酶30 min，10 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液，冷冻干燥，待测。

模拟肠消化阶段：称取5.40 g 氯化钠、0.65 g氯化钾、0.33 g 二水氯化钙溶解在1 L 蒸馏水中，配成肠电解质溶液，7%胰酶-PBS 溶液，4%胆盐-PBS 溶液。量取50 mL 肠电解质、50 mL 胰酶-PBS溶液、100 mL 胆盐-PBS 溶液、59.50 mg 胰脂肪酶、0.013 g 胰蛋白酶，加入剩余胃消化液中，用0.10 mol/L 氢氧化钠溶液调节pH 7，37 ℃，80 r/min 摇床温育2 h。分别于20，40，120，140，160，180 min和240 min 取样，90 ℃水浴灭酶30 min，10 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清，冷冻干燥[23]，待测。

1.3.3 多肽含量的测定 参考高英等[24]方法，配制碱性铜A 试剂和酒石酸钾B 试剂，3.42 mg/mL牛血清白蛋白对照品溶液，分别取样品溶液加水稀释30 倍待测。

根据对照品溶液含量及吸收值，计算可得标准曲线方程：

其中相关系数R2=0.9909。

1.3.4 游离氨基酸含量的测定 按照试剂盒说明，在570 nm 处测定吸光度A：

由此计算可得标准曲线方程：

式中：x——标准品浓度，μmol/mL；y——ΔA。

游离氨基酸含量计算公式：

式中，D——稀释倍数，未稀释为1。

1.3.5 游离氨基酸种类的测定 样品预处理：称取0.1 g 样品加入2 mL 盐酸，充氮气保护，密封110 ℃消化24 h。取100 μL 消化液，浓缩至20 μL，加980 μL 超纯水。

衍生化过程：取混标、待测样本50 μL，加50 μL 蛋白沉淀剂，混匀后13 200 r/min 冷冻离心4 min。取8 μL 上清液，加42 μL 标记缓冲液混匀瞬离。再加20 μL 衍生液混匀、瞬离后置55 ℃恒温衍生15 min。衍生后样本置冰箱，冷却后混匀瞬离，取50 μL 于HPLC-MS/MS 检测。

液相条件：色谱柱：MSLab45+AA-C18（150 mm×4.60 mm，5 μm）；柱温：50 ℃，流速：1 mL/min；流动相：A 为有机相：乙腈（A+B 调节剂）；B 为水相：超纯水（A+B 调节剂）；进样量：3 μL。梯度见表1 所示。

表1 液相梯度洗脱设置Table 1 Liquid phase gradient meter

质谱条件：离子源：+ESI 电喷雾离子源；IS：+5500 V（喷雾电压）；GS1：0.38 MPa（雾化气）；GS2：0.41 MPa（辅助气）；扫描方式：多反应监测；CAD：Medium（碰撞气）；TEM：500 ℃（雾化温度）；CUR：0.14 MPa（气帘气）；CXP：2.0 eV（碰撞室射出电压）；EP：10 eV（射入电压）。

1.3.6 游离脂肪酸含量的测定 按照试剂盒说明书测定吸光值，记为A。经计算得标准曲线：

由此可得游离脂肪酸含量计算公式：

式中，V1——加入样本体积，1 mL；V2——提取液体积，1.2 mL；A——吸光度；M——样品质量，g。

1.3.7 游离脂肪酸种类的测定 样本预处理：取1 mL 样品加入500 μL 提取液（异丙醇∶正己烷体积比2 ∶3，含内标0.20 mg/L），加入钢珠涡旋混匀30 s，用研磨仪处理4 min（40 Hz），超声5 min（冰水浴），重复3 次。然后，将样本于4 ℃12 000 r/min 离心15 min，取上清。剩余样本中加入500 μL上述提取液，重复涡旋、研磨冰浴和离心步骤。取上清，混合涡旋10 s。将上述两种提取液的上清液混合，取800 μL 于2 mL 试管中，氮气吹干。加入500 μL 甲醇-三甲基硅烷基重氮甲烷溶液（二者体积比1∶2），室温静置30 min 后氮气吹干。加入160 μL 正己烷复溶，12 000 r/min 离心1 min，取上清进行GC-MS 检测。

参数设置：进样量：1 μL；分流模式：Split Mode（5∶1）；隔垫吹扫流速：3 mL/min；载气：氦气；色谱柱：DB-FastFAME（90 m×250 μm×0.25 μm）；柱压：0.32 MPa；柱箱升温程序：1 min 升至50 ℃，15 min 升至200 ℃（50 ℃/min），1 min 升至210 ℃（2 ℃/min），15 min 升至230°C（10 ℃/min）；前进样口温度：240 ℃；传输线温度：240 ℃；离子源温度：230 ℃；四级杆温度：150 ℃；电离电压：-70 eV；质量范围m/z：33～400；扫描模式：Scan/SIM；溶剂延迟：7 min。

定量结果：计算公式：

式中，C（con）——样本中游离脂肪酸的含量，μg/g；CS——复溶液游离脂肪酸的质量浓度，ng/mL；V1——复溶体积，mL；V2——加入提取液的体积，μL；V3——取出提取液的体积，μL；M——称重质量，mg。

1.3.8 DPPH 自由基清除能力的测定 取消化终产物，设置10，20，30，40，50 mg/mL 5 个质量浓度梯度，按照试剂盒说明操作。

式中，A测定——测定管的吸光度；A对照——对照管的吸光度；A空白——空白管的吸光度。

1.3.9 清除ABTS+能力的测定 取消化终产物，设置10，20，30，40，50 mg/mL 5 个质量浓度梯度，参考邵洋洋等[25]方法，在波长734 nm 处测定吸光度。计算公式：

式中，A0——蒸馏水+ABTS 工作液的吸光度；A1——样品+ABTS 工作液的吸光度。

1.3.10 三价铁离子还原能力的测定 取消化终产物，设置10，20，30，40，50 mg/mL 5 个质量浓度梯度，参考曲文娟等[26]方法，在700 nm 处测定反应液的吸光值。

1.4 数据处理

采用Excel 2021 进行数据汇总处理，采用GraphPad Prism 8.0 进行方差分析并绘制统计图。试验均设置3 次重复，数据分析结果以平均值±标准差表示，用不同符号或字母表示具有显著差异（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 体外消化过程中核桃游离脂肪酸含量的变化

脂肪的消化主要集中在小肠的上部，它被各种酶和胆汁酸盐水解成甘油和脂肪酸[27]。核桃油在体外消化过程中游离脂肪酸（Free fatty acid，FFA）的变化如图1 所示。随着消化的进行，FFA含量呈持续上升趋势，从13.61 nmol/g 增到20.94 nmol/g。120～180 min 为肠消化阶段，肠道中有胰脂肪酶，主要负责脂质的消化，游离脂肪酸在此期间增加明显，与脂肪相比，游离脂肪酸更易被人体吸收利用，是人体必需的营养物质，有助于促进人体生长发育。核桃油主要在肠消化阶段被分解为游离脂肪酸并被人体吸收代谢。因仅测定游离脂肪酸的总含量无法明确核桃油消化产物的具体变化情况，故对5 个时间点的消化产物组分进行GC-MS 检测。

2.2 体外消化过程中核桃游离脂肪酸组分分析

采用GC-MS 定量检出49 种游离脂肪酸，在体外消化试验所取样品中共检出22 种游离脂肪酸有含量变化，具体种类及含量见表2 所示。亚油酸含量在消化过程中始终维持最高，在180～240 min 期间含量显著增加（P＜0.05），亚油酸是ω-6型脂肪酸，有助于预防心脑血管疾病和降血脂等；游离脂肪酸总量呈上升趋势，从1 080 μg/g 增到413 199.89 μg/g，与上述指标检测结果保持一致，且在120～180 min 期间，游离脂肪酸总量显著提高（P＜0.05），从27 451.01 μg/g 增至283 616.18 μg/g。其中有8 种脂肪酸是0 min 时未检出，而后续消化分解产生的。顺式-11-二十碳烯酸和反式-10-十九碳烯酸的变化最显著（P＜0.05），此类脂肪酸在人体中可起到滋润皮肤、润肠通便等作用。游离脂肪酸增量在0～120 min 时相对平缓，在120～240 min 时增长趋势明显。对不同时间点消化产物的FFA 组分进行聚类分析发现，如图2 所示，消化180 min 时的产物组分与消化240 min 时的产物组分相近，与前3 个时间段差异较大。0 min 即未消化和消化60 min 时与后续产物组分存在差异，其中消化120 min 时的产物组分与其它4 个时间点差异明显。综上结果，初步判断油脂的主要消化部位在肠道，是因为在肠消化阶段游离脂肪酸含量明显增加，与姚轶俊[28]的研究结果相近，肠道的胰脂肪酶是消化脂肪的主要酶类，大部分油脂在肠消化阶段才被分解为游离脂肪酸。

图2 消化产物中FFA 聚类分析图Fig.2 Cluster analysis of FFA in digestive products

表2 不同消化时间点22 种游离脂肪酸（FFA）含量特征Table 2 Content characteristics of 22 kinds of free fatty acids（FFA）at different digestion time points

2.3 体外消化过程中核桃多肽及游离氨基酸含量的变化

人体内的消化酶主要由胃蛋白酶和胰蛋白酶构成，它们与胃酸共同作用即可水解蛋白质[29]。在体外消化模拟过程中，多肽含量呈现先增后减趋势，如图3a 所示。在消化120 min 时达到最大值0.37 mg/mL，整体变化较平缓，从消化初始到消化终点，多肽含量从0.34 mg/mL 增到0.36 mg/mL。如图3b 所示，核桃蛋白质随着消化的进行，逐渐分解为氨基酸，使游离氨基酸（Free Amino Acid，AA）总量从0 min 时的0.59 μmol/mL 升至240 min 时的17.75 μmol/mL，在120 min 后进入肠消化阶段，氨基酸增量明显升高。推测0～120 min 为胃消化阶段，蛋白被分解为多肽，导致多肽含量增加；120～240 min 为肠消化阶段，部分多肽逐渐被分解为氨基酸，整体多肽含量减少，而游离氨基酸总量明显增加，说明蛋白质经胃和肠道的消化分解依次产生多肽和蛋白质两级产物，短肽和游离氨基酸更有利于人体吸收利用，且功能活性优于直接吸收蛋白质。

图3 核桃蛋白质在体外消化过程中多肽及游离氨基酸含量的变化Fig.3 The changes of polypeptide and free amino acid contents in walnut protein during digestion in vitro

2.4 体外消化过程中核桃多肽及游离氨基酸组分分析

采用HPLC-MS/MS 分析具有代表性的20 种游离氨基酸含量。0 min 时样品即核桃蛋白，随消化进行，不同时间点游离氨基酸含量的变化情况见表3 所示。可以看出，0 min 时核桃蛋白中含量最高的是色氨酸0.71 μg/g，当消化240 min 时，含量最高的是精氨酸25.50 μg/g。消化过程中精氨酸和赖氨酸的含量增加明显，精氨酸有助于软化血管，具有抗动脉粥样硬化的作用，赖氨酸有助于提高人体免疫力，促进生长发育。半胱氨酸与冠心病等心脑血管疾病有关[30]，而研究发现核桃蛋白质中不含有半胱氨酸，且随消化进行不会产生半胱氨酸，因此核桃蛋白质可作为维持人体健康的优质营养源；游离氨基酸总量从3.50 μg/g 增至61.85 μg/g，在120～180 min 有明显上升，从20.79 μg/g 增至47.46 μg/g，与上述指标检测结果保持一致。对不同时间点消化产物的AA 组分进行聚类分析发现，如图4 和图5 所示，消化60 min 时的产物组分与消化0 min 即未消化时的产物组分相近，消化180 min 时的产物组分与消化240 min 时的产物组分相近，而消化前60 min 与消化120 min后产物组分有明显差异。蛋白质的消化产物主要以氨基酸和肽段的形式被生物体吸收[31]。小肠中所含有的消化酶种类成分复杂，能进一步水解胃消化产生的氨基酸和肽[31]。综上结果，初步判断蛋白质的主要消化部位在肠道。

图4 消化产物中AA 聚类分析图Fig.4 Cluster analysis of AA in digestive products

图5 消化产物中AA 聚类分析图Fig.5 Cluster analysis of AA in digestive products

表3 不同消化时间点20 种游离氨基酸（AA）具体含量Table 3 Specific contents of 20 kinds of free amino acids（AA）at different digestion time points

2.5 核桃主成分消化产物抗氧化能力

随着消化产物浓度的增加，5 个试验组都保持上升趋势。如图6 所示，Pr 组的整体DPPH 清除能力较高，在消化终产物浓度为50 mg/mL 时有最高清除率为80.65%；Oil 组相对清除能力最弱，在消化终产物浓度为50 mg/mL 时其最高清除率仅40.61%；不同比例复配组中7∶3 比例组清除效果较好，最高清除率为75.88%，3∶7 比例组清除效果较差，最高清除率仅53.70%。初步推断核桃蛋白质的DPPH 清除能力比油的DPPH 清除能力好。如图7 所示，除Oil 组，其它4 组在消化终产物浓度为50 mg/mL 时的清除率趋于一致；Pr 组的整体ABTS+清除能力较高，在50 mg/mL 时有最高清除率81.02%；Oil 组清除能力最弱，在50 mg/mL 时其最高清除率为60.14%；不同比例复配组中7∶3比例组清除效果较好，最高清除率为79.05%，1∶1比例组清除效果较差，最高清除率仅74.61%。初步推断核桃蛋白质的ABTS+清除能力比油的ABTS+清除能力强。如图8 所示，7∶3 和3∶7 复配比例组的还原能力在消化终产物浓度为50 mg/mL 时趋于一致，1∶1 组和Oil 组在质量浓度为30 mg/mL 时吸光度值很接近；Pr 组的整体铁离子还原能力较高，在消化终产物质量浓度为50 mg/mL时测定其在700 nm 处的吸光度，最高值为1.55；Oil 组清除能力最弱，在消化终产物质量浓度为50 mg/mL 时其吸光度值为0.88；不同比例复配组中7 ∶3 比例组清除效果较好，最高吸光度值为1.46，1∶1 比例组清除效果较差，最高吸光度值仅1.20。初步推断核桃蛋白质的铁离子还原能力比油的铁离子还原能力强。

图6 核桃蛋白质和油脂在体外消化过程中DPPH 清除率的变化Fig.6 Changes of DPPH clearance of walnut protein and oil during digestion in vitro

图7 核桃蛋白质和油脂在体外消化过程中ABTS+清除率的变化Fig.7 Changes of ABTS+ clearance of walnut protein and oil during digestion in vitro

图8 核桃蛋白质和油脂在体外消化过程中铁离子还原力的变化Fig.8 Changes of iron reducing power of walnut protein and oil during digestion in vitro

核桃蛋白包括醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白、谷蛋白-1 和谷蛋白-2，这5 种蛋白质均具有一定的抗氧化性[15]。核桃蛋白具有较高的抗氧化活性与小分子多肽含量有关[33]，同时与其氨基酸组成、分子质量和结构有关[15]。核桃油的抗氧化能力主要与酚类物质相关，酚类物质通过获得羟基自由基、过氧自由基和烷氧自由基，起到抗氧化作用[1]。结合上述HPLC-MS/MS 和GC-MS 分析结果可知，由于核桃蛋白质在消化阶段会产生多肽和氨基酸两种次级代谢物，均具有良好的抗氧化性，推断其抗氧化性与多肽含量和氨基酸组成有关，多肽分子质量越小，氨基酸含量越高，抗氧化性越强。核桃油经消化分解主要产生代谢产物为脂肪酸，推断其抗氧化性与脂肪酸含量相关[19]。随着消化的进行，产生的短链脂肪酸含量越高，酚类物质相对含量越少，越容易被氧化，因此其抗氧化性弱于蛋白质。有研究发现核桃粉中含油量越高，其货架期越短[34]，复合核桃油的抗氧化能力也明显优于纯核桃油[35]。添加外源性抗氧化剂，与提高核桃油抗氧化性之间起到协调增效作用，而核桃油本身也含一定的抗氧化活性物质，有助于结合内源的抗氧化成分，优化核桃油抗氧化剂的配方，以此达到有效延长易氧化核桃产品货架期的目的[36]。可以考虑通过添加核桃内源性氨基酸，如精氨酸和赖氨酸等，在不降低核桃产品营养价值的前提下，延长其货架期。

3 结论

利用体外模拟消化试验明确核桃主要成分蛋白和油脂的代谢变化特征，并对两种物质的抗氧化性进行探究。结果表明：0～120 min 为胃消化阶段，产物中多肽含量、游离氨基酸含量和游离脂肪酸含量显著增加（P＜0.05），多肽从0.34 mg/mL 增到0.37 mg/mL，游离氨基酸从3.50 μg/g 增到20.79 μg/g，游离脂肪酸从1 080 μg/g 增 到27 451.01 μg/g；120～180 min 为肠消化阶段，多肽含量逐渐降低，游离氨基酸和游离脂肪酸含量显著提高（P＜0.05），多肽从0.37 mg/mL 降到0.36 mg/mL，游离氨基酸从20.79 μg/g 增到61.85 μg/g，游离脂肪酸从27 451.01 μg/g 增到413 199.89 μg/g。通过体外消化终产物抗氧化能力分析，发现核桃蛋白质的抗氧化能力比油脂的抗氧化能力强，在同时存在蛋白质和油脂的情况下，没有表现出显著的协同作用。以上结论表明核桃油和蛋白质的主要消化部位在肠道，核桃蛋白的抗氧化性高于核桃油，二者混合不利于抗氧化性的提高，在等比混合时甚至导致抗氧化性更差。本研究结果为核桃油内源性天然抗氧化剂的研发，以及开发高抗氧化性核桃功能产品提供研究思路。