香叶醇及其糖苷在茶树中的积累和对红茶香气的贡献

周汉琛，杨霁虹，刘亚芹，王 辉，雷攀登

（安徽省农业科学院茶叶研究所 安徽黄山 245000）

茶叶香气是评价茶叶品质的重要指标之一，目前在各茶类中已鉴定出约700 多种挥发性物质[1]。其中，萜类化合物是茶叶中一类重要的呈香物质[2]，尤其是单萜、倍半萜类等挥发性化合物对茶叶香气品质有着重要贡献[1]。它们大多具有花果香及较低的香气阈值，容易被人类嗅觉感知，比如香叶醇、芳樟醇、橙花叔醇等。香叶醇和芳樟醇作为单萜类香气物质在各类茶叶中普遍含量较高，橙花叔醇对乌龙茶花果香的形成具有重要贡献[3]。

香叶醇具有典型的玫瑰花香，在红茶、绿茶产品中含量丰富。Wang 等[4]研究表明香叶醇是祁门红茶中含量最高的萜烯类化合物。日本的Takeo研究表明，茶树品种（C.sinensis var.sinensis）鲜叶中香叶醇含量显著高于茶树品种（C.sinensis var.assamica），后者中的芳樟醇含量则较高[5-6]。Kang等[7]研究显示，祁门红茶中的香叶醇相对含量（6.89%）显著高于大吉岭红茶（4.28%）、锡兰红茶（0.5%）及阿萨姆红茶（0.32%），这表明香叶醇对祁门红茶的特征香气形成具有重要贡献[7]。此外，关于太平猴魁、龙井绿茶、滇红红茶的研究显示，香叶醇对各类茶的香气品质形成同样具有重要贡献[8-11]。

在茶树中，香叶醇主要以糖苷态储存于细胞中，且主要以樱草糖苷形式储存，还有一部分以葡萄糖苷态储存[12]。这类萜类糖苷物质作为茶叶香气前体，在茶叶加工过程中由葡萄糖苷酶、樱草糖苷酶等水解酶催化并释放出苷元物质[12]。研究显示茶树中香叶醇的生物合成受季节变化以及机械损伤的影响[4-6]。此外，研究表明香叶醇糖苷含量随季节的变化波动较大，春季含量最高，香叶醇糖苷为47.5（峰面积之比），夏季次之（26.6），而秋季最低（13.3）[4]。香叶醇糖苷含量在不同叶片发育状态下也表现出不一致，其中幼嫩叶片中含量最高，表现出幼嫩叶片＞茎＞成熟叶片＞枝条[12]。

香叶醇作为重要的茶香物质，深入研究其在茶树中的积累特性及对茶叶香气的贡献，能够促进后续系统研究茶叶香气形成机制。本研究对不同茶树品种、不同茶树器官、不同时间的香叶醇积累特性进行分析，同时对不同茶树品种鲜叶加工的红茶及加工过程中香叶醇的变化进行研究，旨在为后续研究香叶醇对茶叶香气品质的贡献提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

本研究中供试茶树品种（C.sinensis var.sinensis）“凫早2 号”（FZ2）、“舒茶早”（SCZ）、“皖茶91”（WC91）、“中茶108”（ZC108）、“浙农117”（ZN117）、“皖茶4 号”（WC4）、“槠叶种”（ZYZ）取材于安徽省农业科学院茶叶研究所；供试阿萨姆变 种（C.sinensis var.assamica）“勐库大叶”（MKDY）、“清水3 号”（QS3）、“紫鹃”（ZJ）、“云抗14”（YK14）、“云抗37”（YK37）、“云抗43”（YK43）取材于云南省农科院茶叶研究所；祁门红茶加工过程样（鲜叶、萎凋叶、揉捻叶、不同发酵时间叶）取材于安徽省农业科学院茶叶研究所；茶树品种“舒茶早”第一叶、第二叶、第三叶及茎取材于5 月份，花、根等器官取材于9 月份；不同月份取样均在每月份的下旬。

试验中所用标准品香叶醇购买于Sigma 公司；香叶基樱草糖苷委托山东大学国家糖工程技术研究中心合成。

1.2 仪器与设备

本试验中香叶醇含量分析使用气相色谱质谱联用仪Agilent 7697A-7890A（美国Agilent 公司）；香叶基樱草糖苷分析使用液相-四级杆-飞行时间质谱仪Agilent 1290-Agilent 6545 LC/QTOF（美国Agilent 公司）。

1.3 香叶醇提取方法

参考文献中方法[13-14]，采用顶空固相微萃取（headspace solid phase microextraction，HS -SPME）对样品中的挥发性物质进行吸附。红茶中的挥发性物质提取方法为：准确称取0.2 g 茶粉末，加入10 mL 沸水（茶水比1∶50），于70 ℃水浴平衡5 min 后，利用65 μmol/L PDMS/DVB SPME萃取头（美国Supelco 公司）于70 ℃水浴吸附30 min，后用于GC-MS 分析。

鲜叶样挥发物提取时，利用液氮将鲜叶研磨粉碎后称取0.2 g，加入5 mL 超纯水，于70 ℃水浴平衡5 min 后，利用65 μmol/L PDMS/DVB SPME 萃取头于70 ℃水浴吸附30 min，后用于GC-MS 分析。

1.4 GC-MS 分析、香叶醇鉴定及定量

气相质谱联用仪Agilent 7697A-7890A 用于本研究中挥发性物质分析，其中气相色谱柱为DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm；美国Agilent 公司），气相不分流，流速为1.0 mL/min，载气为氦气，色谱柱升温程序为：初始温度50 ℃，保持1 min；以10 ℃/min 速率上升到100 ℃，并保持1 min；后以4 ℃/min 速率上升到200 ℃，并保持1 min；以16 ℃/min 速率上升到280 ℃，并保持7 min。

香叶醇鉴定依据NIST 数据库、化合物保留指数（retention indices，RI）及标准品。香叶醇定量方法为使用标准品定量，准确吸取1 μL 300 μg/mL 香叶醇标准品加入5 mL 或10 mL 超纯水，于70 ℃水浴平衡5 min 后，利用相同SPME 萃取头于70 ℃水浴吸附30 min 后上机分析。香叶醇含量计算方式为：利用样品中峰面积与标准品峰面积之比计算含量，其中红茶样品中香叶醇含量表示为μg/L，鲜叶中香叶醇含量表示为μg/g（鲜重，fresh weight，FW）。

1.5 香叶基樱草糖苷提取

利用液氮将鲜叶样品、红茶加工过程样研磨粉粹，准确称取0.100 g，并立即加入750 μL 预冷的含0.1%甲酸的甲醇，充分振荡15 s 后超声15 min，后在10 000 r/min 下离心10 min，取上清液稀释10 倍后，采用0.22 μm 有机系滤膜过滤，并用于液相质谱分析。

1.6 UPLC/Q-TOF 分析

Agilent 1290 超高效液相色谱仪结合Agilent 6545 LC/Q-TOF 四级杆-飞行时间质谱仪用于样品中的香叶基樱草糖苷分析；色谱柱为Zorbax revese-phase 柱（RRHD SB-C18 3×150 mm，1.8 μm）。离子源为Dual ESI，A 相洗脱液为含0.1%甲酸的蒸馏水，B 相洗脱液为含0.1%甲酸的乙腈。LC-MS/MS 运行时洗脱总时间为35 min：首先5% B 保持8 min；后10 min 内B 相梯度由5%上升到45%；5 min 内B 相梯度从45%上升到65%，并保持4 min；3 min 内B 相梯度从65%下降到40%；3 min 内B 相梯度从40%下降到5%，并保持2 min。流速始终为0.4 mL/min，样品进样量为2 μL，色谱柱温度设为35 ℃。MS 采集率为1 spectra/s，采集范围设为100～700。Auto 模式下MS/MS采集率为2 spectra/s。离子源碰撞能量为25 和35 eV 两种。

本研究中样品在负离子模式下运行，负离子模式下香叶基樱草糖苷提取母离子（m/z）为493.22。本试验条件下，香叶基樱草糖苷出峰时间约为17.6 min。采用Agilent Masshunter（B.07.00版本）和Agilent 定量软件Qualitative Analysis（B.07.00 版本）进行化合物的分析。样品中香叶基樱草糖苷通过标准品MS/MS 峰图进行鉴定，并通过与标准品峰面积之比进行化合物的定量，含量表示为μg/g（FW）。

1.7 香叶醇生物合成候选基因筛选与功能分析

利用开放网站TPIA（http：//tpdb.shengxin.ren/）获得“舒茶早”二代基因组组装数据。依据Xia 等[15]研究结果显示，二代基因组CSS2.0 中共有72 个候选萜类合成酶基因。通过基因结构[16]、蛋白结构域解析（http：//pfam.xfam.org/）获得具有全长功能的单萜类合成酶基因或双功能萜类合成酶基因。

全长克隆候选基因，并与植物双元表达载体PBI121 连接，以农杆菌介导的遗传转化体系瞬时过表达于本氏烟草叶片中，3 d 后收取叶片。其中以侵染缓冲液（MES 10 mmol/L，MgCl220 mmol/L，乙酰丁香酮200 μmol/L）处理叶片为阴性对照，瞬时过表达罗勒（Sweet Basil）香叶醇合成酶基因ObGES 叶片为阳性对照。将瞬时表达叶片液氮研磨后，称取0.2 g，加入5 mL 超纯水以及200 mg/mL AR2000（广谱糖苷酶）于37 ℃水浴平衡20 min 后，利用65 μmol/L PDMS/DVB SPME 萃取头于70 ℃水浴吸附30 min，后用于GC-MS 分析。

1.8 数据分析

采用SPSS 19.0 软件对试验样品间的差异进行单因素方差分析（ANOVA），其中运算方法为最小显著性差异法（LSD），以检验不同样品间的显著性（P＜0.05）。相关性分析利用GraphPad Prism9软件（GraphPad，USA）完成。

2 结果与分析

2.1 香叶基樱草糖苷在茶树中的积累特性

香叶醇在茶树中主要以糖苷态储存在细胞中，且主要以樱草糖苷型储存，约占70%～78%[17]。为量化香叶醇积累差异，本研究分析了香叶基樱草糖苷在不同茶树品种间、茶树不同组织器官中的含量变化。结果显示6 个供试中国变种（C.sinensis var.sinensis）鲜叶中显著积累更多的香叶基樱草糖苷，分布范围为1.4～3.3 μg/g，而6 个阿萨姆变种（C.sinensis var.assamica）叶片中香叶基樱草糖苷的含量普遍较低，约为0.1～0.6 μg/g（图1a）。在12 个供试茶树品种中，茶树品种WC4嫩梢中的香叶基樱草糖苷含量最为丰富，其次为祁门槠叶种ZYZ（图1a）。

图1 不同茶树品种及“舒茶早”不同组织器官中香叶基樱草糖苷积累变化Fig.1 The accumulation patterns of geraniol and its primeveroside in the fresh leaves of different tea cultivars and in the different tissues of the SCZ cultivar

以茶树品种“舒茶早SCZ”为对象，分析了茶树不同组织器官中香叶基樱草糖苷含量变化。结果显示，香叶基樱草糖苷在第一叶中含量最高，为1.17 μg/g；在茶树根部的含量最低，为0.02 μg/g（图1b）；茶树叶片幼嫩部位积累更多的香叶基樱草糖苷，而在发育程度高的叶片中，香叶基樱草糖苷含量较低。在茶树花器官中，花瓣中的香叶基樱草糖苷含量最低，约为0.07 μg/g，随着茶花逐渐盛开，香叶基樱草糖苷含量显著下降（图1b）。在茶树不同组织器官中，香叶基樱草糖苷含量变化总体为：叶＞花＞根。

2.2 不同月份中香叶醇积累特性

为探究不同月份下茶树中香叶醇的积累特性，本研究分析了不同茶树品种嫩梢在不同月份中的香叶醇含量。在所测4 个茶树品种中，香叶醇均在3 月份嫩梢中的含量最为丰富（图2）。尤其是茶树品种WC4，在3 月份嫩梢中，香叶醇含量达到8.01 μg/g，而其在2 月份嫩梢中含量只有0.54 μg/g；与2 月份相比，3 月份WC4 嫩梢中香叶醇积累量约增加了15 倍，然后随着月份增加，香叶醇含量逐渐降低；不同月份下，茶树品种FZ2 和SCZ 嫩梢中香叶醇变化规律与茶树品种WC4 基本相同，均在3 月份嫩梢中含量最高，而茶树品种ZC108 在5 月份嫩梢中的香叶醇含量略高于4 月份中的含量（图2）。在所测茶树品种中，6、7、8 月份嫩梢中的香叶醇含量变化不大，基本持平（图2）。

图2 不同月份下茶树鲜叶中香叶醇的含量变化Fig.2 The accumulation patterns of geraniol in the fresh leaves of different varieties in different months

2.3 香叶醇对红茶香气的贡献分析

本研究分析了祁门红茶加工进程中的萎凋叶、揉捻叶、不同时间发酵叶中香叶基樱草糖苷的含量变化，结果显示香叶基樱草糖苷在萎凋进程中开始下降，在揉捻过程中剧烈减少，约减少了90%，随着发酵进程延长，香叶醇樱草糖苷进一步被水解，发酵完成时，只有鲜叶中的3.8%（图3a），这与已有的报道结果相一致[18-19]。

图3 香叶醇及其樱草糖苷在祁门红茶加工中不同品种红茶中的含量及OAV 值Fig.3 The contents of geraniol and its primeveroside in the processing stage of Keemun black tea and the tea infusions of six black tea samples and the odor activity value of geraniol in six tea infusions

以黄山地区6 个茶树品种红茶为例（图3b），气相质谱分析结果显示6 个品种红茶中香叶醇丰度均较高，其中WC4 品种红茶中的香叶醇丰度显著高于其它品种红茶（图3b）。含量计算结果显示WC4 品种红茶茶汤中香叶醇含量最高，约为187.34 μg/L，其次为SCZ 红茶茶汤，香叶醇含量为49.27 μg/L；槠叶种ZYZ 红茶茶汤中香叶醇含量为45.06 μg/L；WC91 红茶茶汤中的香叶醇含量最低，为26.01 μg/L（图3c）。

据文献报道显示，香叶醇在水中的阈值约为3.2～75 μg/L，不同研究中所用阈值有较大差异，常用的有3.2 μg/L[1]，40 μg/L[10]，75 μg/L[11]。根据L.J.van Gemert 新书中的标注，最近文章中的研究表明香叶醇阈值为6.6 μg/L[20]。因此，本研究中以阈值6.6 μg/L 计算了香叶醇在6 个红茶茶汤中的香气活性值（odor activity value，OAV）。结果表明，WC4 品种红茶茶汤中香叶醇香气活性值最高，为28.38，其次为SCZ 茶汤，为7.47（图3d）。一般认为香气化合物OAV 值＞1 是对茶汤香气有贡献[11]，而在本研究中的6 个红茶茶汤中，香叶醇OAV 值均＞1，约为3.93～28.38，这表明香叶醇对红茶香气构成具有重要贡献。

2.4 香叶醇生物合成相关萜类合成酶候选基因分析

基于二代基因组数据，显示共有72 个候选茶树萜类合成酶基因，通过与已发表并鉴定功能的萜类合成酶基因结构进行关联分析，推测具有全长的单萜合成酶/双功能萜类合成酶基因共有23个。本研究利用茶树不同组织器官中香叶基樱草糖苷的含量与各候选基因表达量进行Pearson 相关性分析（图4a），结果显示共有7 个萜类合成酶基因表达量与香叶基樱草糖苷含量变化显著相关，分别为CSS0012478（R=0.984），CSS0006343（R=0.865），CSS0007975（R=0.978），CSS0012706（R=0.979），CSS0013756（R=0.817），CSS0027229（R=0.820）和CSS0025755（R=0.984），其中CSS0012478、CSS0007975、CSS0012706 和 CSS00 25755 表达模式与香叶基樱草糖苷含量变化达到极显著相关（R＞0.9 且P＜0.01）。

图4 茶树中香叶醇生物合成萜类合成酶候选基因筛选与功能分析Fig.4 The identification of geraniol synthase candidate genes and the functional verification

通过全长克隆，将CSS0007975、CSS0012478和CSS0025755 瞬时过表达于本氏烟草叶片中，其中以侵染缓冲液瞬时表达叶片为阴性对照，以已鉴定功能的罗勒香叶醇合成酶ObGES 为阳性对照。结果显示，与阴性对照相比，CSS0007975、CSS0012478 和CSS0025755 瞬时过表达本氏烟叶片中香叶醇丰度虽略有增加但未达到显著水平，而瞬时过表达ObGES 本氏烟叶片中，香叶醇丰度显著提升（图4b）。

3 讨论与结论

香叶醇在不同茶树品种中的差异已经多有报道[2，4-5]，且目前常以萜烯指数（芳樟醇+芳樟醇氧化物/芳樟醇+芳樟醇氧化物+香叶醇）来表明茶树品种间香叶醇与芳樟醇积累的差异[5]。日本Takeo[5]的研究显示，斯里兰卡地区阿萨姆种（Assamica）茶树变种萜烯指数可达到1；杂交变种约为0.2～0.7，而中国种（Sinensis）茶树变种萜烯指数普遍较低，最低可达到0.07。Xia 等[15]的研究表明我国云南地区18 个常见栽培茶树品种主要是阿萨姆种茶树变种，与安徽、浙江地区栽培品种（系）差异较大。本研究中，6 个供试中国种茶树变种为安徽、浙江地区选育及当地栽培品种，其香叶基樱草糖苷含量显著高于6 个供试阿萨姆种茶树变种，这与茶树变种的遗传背景密切相关。Xia 等[15]的研究即表明，栽培品种在遗传驯化中存在选择性，两个变种间共有的驯化基因只有206 个，而阿萨姆种茶树变种独有驯化基因为548 个，中国种茶树变种独有驯化基因538 个，这表明不同茶树栽培品种（系）在遗传驯化中逐渐产生差异，使得内源次级代谢途径改变，并导致代谢产物积累不同。

茶树叶片中积累较多的香叶醇与萜类合成酶表达模式密切相关[21]。前期研究显示，茶树单萜类合成酶表达量在叶片中积累较高，而倍半萜类合成酶则在花中表达较高[21]。不同月份中，3 月份嫩梢中香叶醇积累更丰富，这与王华夫研究较一致[4]。随着月份增加，光照增强、温度升高，茶树次级代谢受到调控，影响了香叶醇生物合成量。

本研究中显示，祁门红茶在加工揉捻阶段，香叶基樱草糖苷含量极显著下降。已有的研究表明糖苷类物质可能主要储藏在液泡中[22]，而樱草糖苷酶基因已被证明定位于细胞壁中[23]。在鲜叶采摘后，水分充足，细胞形态完整，随着萎调进程的增加，水分逐步散失，细胞透性增加[24]，部分香叶基糖苷水解并释放出苷元；在红茶加工揉捻阶段，酶与底物充分接触，结合态的香叶醇几乎全部转成游离态，进而对红茶香气产生贡献。本研究中6个品种红茶中香叶醇的香气活性值均＞1，且最高达到约28。祁门红茶的“祁门香”被认为具有浓郁的玫瑰花香、甜香等[25]，显著有别于中国云南地区的滇红红茶，可能存在香叶醇贡献率的差异。

本研究中，初步对香叶醇生物合成相关萜类合成酶基因进行了筛选与功能验证，结果显示与ObGES 过表达相比，3 个茶树萜类合成酶候选基因合成香叶醇功能较弱且可能为假阳性，有待进一步分析。

综上所述，香叶醇在茶树叶片中富集，且以糖苷态储存在细胞中，在红茶加工过程的揉捻工序中，因细胞破碎水解释放并对其香气产生贡献。不同月份下、不同茶树品种中的香叶醇积累特性均有不同，推测这与香叶醇生物合成途径受温度、光照调控相关，以及存在遗传背景的差异。本研究结果为后续研究香叶醇生物合成及调控机制提供了理论依据。