铁死亡在年龄相关性黄斑变性机制中的研究进展

雷敏 胡丽丽 陈婷 艾明

作者单位：430060湖北省武汉市,武汉大学人民医院眼科中心(雷敏,陈婷,艾明);430064湖北省武汉市,武汉大学附属爱尔眼科医院(胡丽丽)

年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration, AMD)是一种累及黄斑部的神经退行性视网膜疾病,是发达国家老年人中心视力不可逆丧失的主要原因[1]。研究数据显示,55～64岁人群中,晚期AMD的患病率为0.2%,而85岁以上人群中可达13.1%[2]。到2040年,全球患有AMD的人数预计将达到3亿左右。因此,AMD将成为一项具有重大社会经济影响的公共卫生问题。临床上将AMD分为早期AMD(中等大小的玻璃膜疣和视网膜色素改变)和晚期AMD(新生血管型和非新生血管型,即“湿性”和“干性”)[1]。AMD的发病机制尚不清楚,但普遍认为病理性血管发生、氧化应激、免疫反应及炎症是其主要病因[3]。玻璃体内注射抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)药物在治疗湿性AMD方面非常有效,显著降低了其致盲率[4]。但是,对于干性AMD尚缺乏有效的治疗策略。近年来,越来越多的研究证明,铁死亡与AMD发病机制有关的病理性血管发生、氧化应激、免疫反应及炎症反应等密切相关[5],本文将对此进行综述。

1 铁死亡及其相关机制

铁死亡是一种由依赖铁的脂质过氧化驱动,并受多种细胞代谢途径(包括氧化还原稳态、铁处理、线粒体活性,以及氨基酸、脂质、糖代谢)和各种与疾病相关的信号通路的调节,不同于细胞凋亡、坏死性凋亡和细胞焦亡的调节性细胞死亡程序[6]。铁死亡与多种病理生理机制有关,如肿瘤抑制、神经退行性变、缺血/再灌注损伤和血色素沉积症等[7-9]。各种氧化和抗氧化途径将自噬和膜修复机制结合起来,形成了铁死亡过程中脂质过氧化和质膜损伤的过程。

1.1 谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)调节的铁死亡途径 在通过抑制胱氨酸谷氨酸转运受体(Xc-系统-GSH-GPX4)调节的铁死亡途径中,Xc-系统介导的胱氨酸吸收在铁死亡中有重要作用[10]。Xc-系统是一种异二聚体胱氨酸/谷氨酸反转运蛋白,由2个核心成分组成:SLC7A11(溶质载体家族7成员11:催化亚基)和SLC3A2(溶质载体家族3成员2:锚定蛋白)。GPXs在谷胱甘肽(glutathione, GSH)的辅助下介导磷脂氢过氧化物(PL-OOH)还原产生相应的醇(PL-OH),从而抑制铁死亡。由于SLC7A11的编码的轻链是Xc-系统独有的亚基,因此SLC7A11表达水平通常与反转运蛋白的活性呈正相关,Xc-系统的抑制会导致SLC7A11的代偿性转录上调。在铁死亡诱导剂(erastin)和柳氮磺胺吡啶诱导的铁死亡中,发现了SLC7A11上调[11]。综上,erastin可通过抑制Xc-系统,阻止GPXs的关键辅助因子GSH吸收,导致GPXs活性降低,脂质活性氧堆积,引起细胞死亡。

1.2 脂质过氧化与铁死亡 致死性脂质过氧化物(lipid peroxide, LPO)的累积是铁死亡的主要特征。脂质过氧化的激活最终导致PL-OH脂质自由基、LPO的分解产物以及氧化和修饰蛋白质的堆积,这种连锁反应导致细胞器膜和细胞膜破裂[12]。在铁存在的情况下,细胞膜脂质的多不饱和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acids, PUFAs)链能够经过一系列反应形成脂质活性氧[8],这些脂质氢过氧化物能形成有毒性的脂质自由基损伤细胞。同时,这些自由基能转移邻近PUFAs的质子,启动新一轮的脂质氧化反应,加剧氧化损伤。Shintoku等[13]发现,脂加氧酶(LOX)的过表达增强了erastin和RAS-selective-lethal-3(RSL3)诱导的铁死亡,而LOX抑制剂可减少PUFA片段的累积,阻止其铁死亡过程。某些LOXs是PUFAs的非依赖性血红素双加氧酶,可以直接氧化生物膜上的PUFAs和含PUFA的脂质,诱导铁死亡。因此,脂质过氧化介导的细胞损伤是铁死亡所必需的环节。

1.3 铁死亡代谢 多种代谢途径(如脂肪生成、自噬和线粒体三羧酸循环)和信号通路(如E-cadherin-NF2-Hippo-YAP通路、AMPK信号通路以及p53和BAP1通路)在铁死亡中起着重要作用[6]。Gao等[14]证明了自噬通过调节细胞铁稳态和活性氧(ROS)的产生在调节铁死亡中发挥重要作用。铁诱导使自噬激活,细胞铁蛋白降解,不稳定铁积累,铁蛋白吞噬受体介导铁蛋白吞噬促进铁死亡。Yu等[15]的研究发现,抑制葡萄糖的主要营养传感器O-GlcNAcylation修饰可以促进铁自噬,使活性铁向线粒体积聚,增强自噬能力,释放出更多不稳定铁,使细胞对铁死亡更敏感。Lee等[16]发现,在缺乏葡萄糖的情况下,磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)被激活,可扰乱PUFAs的生物合成来对抗铁死亡。而Song等[17]认为,AMPK在Beclin1(BECN1)的磷酸化中增加与SLC7A11的结合,从而促进铁死亡。YAP以多种铁死亡调控因子为靶标,与铁死亡的易感性相关的Hippo通路的活性随着Hippo的抑制和YAP的激活而增加[18]。Jiang等[19]用ROS干预p53基因沉默的细胞,细胞活性没有变化,但激活p53基因后再用ROS处理,细胞死亡率高达90%,说明p53基因激活后细胞抗氧化能力显著降低。同时发现p53通过与SLC7A11启动子结合位点(p53-BS)结合来抑制SLC7A11转录,抑制Xc-系统吸收胱氨酸,使胱氨酸依赖的GSH过氧化物酶活性降低,细胞抗氧化能力降低,脂质活性氧水平升高,引起细胞铁死亡。

1.4 铁死亡中的铁 铁是一种氧化还原活性金属,其输入、储存和输出之间的不平衡,可能会影响细胞对铁死亡的易感性。转铁蛋白受体表达增加会增强铁的输入,引发胶质瘤细胞中的铁死亡。核受体共激活因子4介导铁蛋白自噬传递到溶酶体,通过增加细胞内不稳定铁池 (LIP)的水平来调节脂质过氧化和铁死亡[20]。近来,Prominin2蛋白已被证明可通过促进铁蛋白输出抑制铁死亡[21]。铁螯合剂抑制了erastin介导的铁死亡,而外源性铁会增强此过程。因此,铁的吸收和利用影响铁死亡的诱导过程。

1.5 铁死亡的其他调节通路 铁死亡电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channels, VDACs)是转运离子和代谢产物的跨膜通道。Yagoda等[22]发现erastin可与VDACs的异构体结合。用小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)干预VDAC2或VDAC3表达后,细胞对erastin介导的铁死亡产生耐受,但是过表达VDAC2和VDAC3并未提高其对erastin的敏感性,所以VDAC2和VDAC3是铁死亡的必要非充分条件。DeHart等[23]认为,erastin作用于VDACs,使线粒体功能紊乱,膜通透性增强,氧化性物质释放,引起细胞死亡。在氧化应激状态下,甲硫氨酸可通过硫转移途径转化为胱氨酸,合成GSH,协助GSH过氧化物酶抑制脂质活性氧生成,避免细胞氧化损伤,因此硫转移途径可抑制铁死亡的发生。Tang等[24]证实了血红素加氧酶1可以诱导脂质过氧化反应从而导致铁死亡的发生。最近研究发现,铁死亡抑制蛋白1 (ferroptosis suppressor protein 1, FSP1)/泛醌系统可以防止由GPX4的药理抑制或基因缺失引起的铁死亡,FSP1通过减少泛醇/α-生育酚来防止脂质过氧化相关的铁死亡[25]。

2 铁死亡与AMD

AMD的潜在机制包括氧化应激介导的视网膜色素上皮(retinal pigmen epithelium,RPE)细胞死亡和随后的视网膜感光细胞死亡[5]。细胞内铁浓度在3个水平上受到调节:通过调节转铁蛋白受体表达来控制铁摄取、调节LIP和铁输出。铁死亡与AMD发病机制有关的病理性血管发生、氧化应激、免疫反应及炎症反应等密切相关。

2.1 AMD与脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV) 过量的铁是促进血管生成的。铁介导视网膜神经节和RPE细胞中的G蛋白偶联受体信号传导,并刺激VEGF的表达和分泌。Zhao等[26]发现,激光诱导3 d的CNV小鼠模型RPE细胞中SLC7A11蛋白以及VEGFA的表达达到峰值,而腹腔注射SLC7A11抑制剂后,RPE-脉络膜复合体中Fe2+含量和GPX4表达增加,CNV的面积扩大。Liu等[27]发现,小鼠玻璃体腔注射柠檬酸铁铵(ferric ammonium citrate,FAC)1个月时,光学相干断层扫描(optical coherence tomography,OCT)提示视网膜出现新生血管病变和RPE萎缩,4个月时眼底荧光素血管造影(fluorescence fundus angiography,FFA)及吲哚青绿血管造影(indocyanine green angiography,ICGA)显示地理萎缩区荧光素渗漏以及脉络膜水平的血管网,提示Ⅲ型脉络膜新生血管病变。同时,病理切片免疫荧光显示,注射FAC眼视网膜RPE细胞的紧密连接蛋白1(ZO-1)标记减少,并可观察到二脒基苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)标记的血管内皮细胞的细胞核,提示CNV形成。以上研究提示CNV的发展与铁死亡密切相关。

2.2 AMD与氧化应激和脂质过氧化 GSH是RPE细胞中最突出的抗氧化剂,在视网膜中浓度较高。研究发现,由GSH耗竭、叔丁基氢过氧化物(tBH)孵育或补充亚铁引起的铁死亡是氧化应激介导的RPE细胞死亡的主要模式[28]。铁诱导的GSH耗竭导致GPX4失活,Xc-系统活性增加,过量的铁通过芬顿反应形成有毒的ROS,ROS与细胞器中的PUFA反应,产生LPO,从而导致细胞死亡。LOX的铁中心可以催化脂质氢过氧化物(LOOH)的形成,而LIP的Fe2+参与LOOH分解反应以产生脂质过氧化的亲电产物。当铁水平超过细胞抗氧化能力时,ROS的产生会损害视网膜内的DNA、蛋白质和脂质。视网膜细胞对脂质过氧化高度敏感,铁过载会增加氧化应激及其敏感性[12]。在老化的视网膜中,抗氧化防御系统活性降低,对氧化应激和铁诱导的氧化损伤抵抗力减弱。AMD病人RPE细胞吞噬能力下降,光感受器残留小体中含有的羧乙基吡咯、不饱和脂肪酸的氧化片段和荧光双维甲酸衍生物等有毒物质使RPE功能受损,最终沉积在Bruch’s膜中,成为玻璃膜疣的一部分[29]。Tang等[24]在视网膜色素上皮细胞中观察到铁死亡抑制剂ferrostatin-1和去铁胺(Desferal)减弱了氧化应激诱导的RPE细胞的脂质过氧化、GSH耗竭和Fe2+积累,表明铁死亡在氧化应激诱导的RPE细胞死亡中发挥重要作用。

2.3 AMD与炎症反应和免疫反应 玻璃膜疣的主要成分β淀粉样蛋白1-40寡聚体是慢性炎症的强效刺激剂,在眼内形成促炎微环境,刺激RPE或脉络膜血管平滑肌细胞中炎症介质的表达,从而促进炎症的发生和发展[30]。小胶质细胞、巨噬细胞和其他表达IL-6的细胞在干性AMD供体的视网膜中显著增加[31]。小鼠玻璃体腔铁注射使神经视网膜中IL-1β、IL-6和补体因子C3的mRNA水平增加。此外,氧化应激和芬顿反应相关的双维甲酸降解生成羰基化合物,可以诱导RPE细胞产生IL-1、IL-6、TNF-α等细胞因子,这些细胞因子会募集包括小胶质细胞和巨噬细胞在内的炎性细胞[31],表明AMD发病机制与补体及神经炎症的激活相关。Cao等[32]在AMD患眼病理切片中发现脉络膜巨噬细胞、视网膜神经感觉层的色素沉着细胞、视网膜下的单个脱落细胞以及萎缩区的RPE细胞等的免疫标志物CD68和CD163呈强阳性,表明单个层内细胞及其他异常细胞均表现出CD68和CD163免疫反应性。光诱导自由基产生的一种剧毒的胆固醇氧化物——7-酮胆固醇,经自由基介导机制与AMD发生发展相关[33]。此外,铁过载使胆固醇转运蛋白靶向缺失,胆固醇代谢物累积,视网膜下间隙的巨噬细胞和小胶质细胞浸润,导致光感受器功能障碍和神经退行性变。此外,铁诱导的视网膜中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)炎性体发挥重要作用,这是一种与AMD发病机制相关的免疫信号复合体[34]。因此,炎症反应和免疫反应在AMD的发生发展中发挥重要作用。

3 铁死亡在AMD治疗中的研究进展

传统的湿性AMD治疗包括激光光凝、维替泊芬光动力疗法、手术治疗等,近年来,抗VEGF已经成为其一线治疗[33]。早期干性AMD不会立即威胁病人视力,因此定期随访尤为重要。目前,世界上尚没有针对干性AMD的有效治疗方法。美国眼科学会(AAO)指南推荐用叶黄素和玉米黄质替代β胡萝卜素预防AMD的发生发展[35]。AMD的铁死亡相关基因以及干细胞治疗等仍在探索之中。

铁螯合剂对AMD具有保护作用。最近的研究报告了铁螯合疗法在视网膜变性和几种神经退行性疾病中的作用[7-9]。目前临床上可用的铁螯合剂包括Desferal、去铁酮、地拉罗司和水杨醛异烟酰肼[36-37]。去铁胺锌是一种Desferal的锌复合物,小鼠腹腔注射可诱导Desferal在视网膜中积累,从而减轻视网膜变性和氧化应激诱导的神经毒性和视网膜毒性[38]。α-硫辛酸可减缓小鼠视网膜中光诱导的光感受器退化。Zhao等[26]发现SLC7A11可以发挥抗氧化作用,通过激活或增加GPX4来减少AMD小鼠视网膜CNV面积,使细胞免于铁死亡。以上发现为临床对抗VEGF治疗不敏感或易复发的湿性AMD以及干性AMD病人提供了一种新的治疗思路。

随着新型生物制剂的研发,高生物相容性的强效铁结合纳米普鲁士蓝类似物CaPB旨在抑制RPE细胞死亡和随后的感光细胞退化。Tang等[39]发现玻璃体腔注射CaPB的AMD小鼠疗效显著,初步揭示了CaPB纳米颗粒可通过抑制RPE细胞的铁死亡防止视网膜变性。Gupta等[40]发现一种脂质运载蛋白2(LCN2)单克隆抗体可与干性AMD小鼠模型中的LCN2和其同源二聚体变体结合,抑制其自噬和铁死亡途径,挽救其视网膜功能,为AMD提供了一种可能的治疗策略。

近年来用于AMD治疗的干细胞临床试验相继开展。Schwartz等[41-42]的Ⅰ/Ⅱ期临床研究表明,人胚胎干细胞(human embryonic stem cells, hESCs)衍生的RPE细胞疗法安全有效地提高了AMD病人的视力预后,为AMD的干细胞治疗提供了更多的可能性。

4 小结及展望

综上,AMD是多种因素引起的一种不可逆性的老年性致盲眼病,其发病机制尚未明确。目前,对于湿性AMD病人玻璃体内抗VEGF治疗取得了一定疗效,但对于抗VEGF无效以及干性AMD病人尚缺乏有效的治疗措施。铁死亡作为一种独特的细胞死亡程序,在AMD发病机制有关的病理性血管发生、氧化应激、免疫反应及炎症反应等病理过程中发挥重要作用。随着铁死亡机制研究的不断深入,基于铁死亡治疗AMD的研究也从分子水平、基因水平到干细胞水平不断探索,有望为AMD的治疗提供可行的个性化方案。