沙苑子总黄酮基于RANK/RANKL/OPG 信号轴抑制MG-63 骨肉瘤细胞生长并促使其凋亡的机制研究*

李 婷 张 旗 汪国友 李东波 何 跃 吕 政 石厚银 沈骅睿△

（1.西南医科大学，四川 泸州 646000；2.四川省合江县中医医院，四川 合江 646000；3.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州 646000；4.四川省康复医院，四川 成都 610000；5.成都中医药大学，四川 成都 610000）

【目的】 目的 观察沙苑子总黄酮（FAC）基于RANK/RANKL/OPG 信号轴对MG-63 骨肉瘤细胞凋亡的影响。方法 不同浓度FAC、顺铂（阳性对照）作用于MG-63 骨肉瘤细胞后，采用CCK-8 法检测不同时间点的增殖抑制作用，划痕实验检测细胞迁移修复能力，Hoechest染色、流式细胞术检测细胞凋亡，PCR和Western blotting检测细胞RANK、RANKL、OPG 和凋亡相关因子Caspase-3 mRNA 和蛋白表达。结果 CCK-8 法显示，除50 mg/L FAC 对24、48 h 细胞存活率影响相近（P ＞0.05）外，其余浓度FAC（100、200、300、400 mg/L）均可显著抑制MG-63 骨肉瘤细胞的增殖（P ＜0.05），并呈一定的时间和浓度依赖性。划痕实验显示FAC 及顺铂对MG-63骨肉瘤细胞的迁移修复能力有抑制作用，并表现出浓度依赖性，低、中、高浓度组（100、200、300 mg/L）迁移修复率分别为（31.62±0.85）%、（25.38±1.18）%、（6.05±2.96）%，阳性对照组（10 mg/L顺铂）为（14.74±2.58）%。Hoechest荧光染色和流式细胞术显示FAC、顺铂作用48 h可促进MG-63骨肉瘤细胞凋亡。对照组、阳性对照组细胞凋亡率为7.84%、93.61%，低、中、高浓度组凋亡率分别为4.46%、8.51%、98.15%。PCR 显示FAC和顺铂降低MG-63骨肉瘤细胞OPG 的mRNA 表达，增强RANK、RANKL、Caspase-3 的mRNA 表达。Western blotting 显示FAC 和顺铂降低MG-63骨肉瘤细胞OPG 蛋白表达水平，上调RANK、RANKL、Caspase-3蛋白表达水平。结论 FAC在体外具有促进MG-63骨肉瘤细胞凋亡作用，300 mg/L FAC促凋亡作用与10 mg/L 顺铂相当，其促凋亡机制可能与RANK/RANKL/OPG 信号轴调控有关。

骨肉瘤是原发性恶性骨肿瘤［1］，其起源于间叶组织，好发于儿童和青少年，具有恶性程度高、生长速度快、易早期转移、预后差等特点［2］。手术、放化疗及二者联合是目前骨肉瘤的主要治疗方法。因为治疗方法的革新，1970 年代以来无转移骨肉瘤患者的5 年生存率提高到约70%［3］。但是30 多年来，骨肉瘤患者的预后没有显著变化，特别是初诊时就已经发生转移的患者，其5 年生存率仅约20%［4］。部分患者对化疗不敏感、药物耐药及肿瘤复发是目前骨肉瘤治疗上的一大难题［5］。

沙苑子是豆科植物扁茎黄芪的干燥成熟种子，黄酮类是沙苑子的主要有效成分［6］。研究表明，沙苑子总黄酮（FAC）具有抗肿瘤、降压、调脂、促进骨髓间充质干细胞分化等作用［7-12］。本研究以MG-63骨肉瘤细胞为研究对象，在证实FAC 具有抑制其增殖的同时，进一步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 人MG-63 骨肉瘤细胞株购自河南多沃生物科技有限公司，用含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗的DMEM 培养基在5% CO2、37 ℃、相对湿度70%～80%的培育箱中培养，细胞密度达瓶底80%～90%时进行传代或将细胞冻存，取对数生长期细胞进行实验。

1.2 药物及试剂 FAC 由西南医科大学药学院税丕先教授提取、提供，纯度32.07%；Cisplatin3 顺铂（SC5170，北京索莱宝科技有限公司）；25 cm2细胞培养瓶（KG20025，上海科进生物技术有限公司）；BCA蛋白定量试剂盒（BL521A，合肥兰杰柯科技有限公司）；CCK8试剂盒（CKD4，日本同仁化学研究所）；Hoechst33258染色液（C0020-10，北京索莱宝科技有限公司）；AnnexinVFITC/PI 细胞凋亡试剂盒（E-CK-A211，武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；山羊抗兔二抗-HRP、山羊抗小鼠二抗-HRP（70-GAR0072、70-GAM0072，苏州蚂蚁淘生物科技有限公司）；RNA 提取试剂盒（NO.RE-03014，成都福际生物技术有限公司）；实时荧光定量PCR 试剂盒、逆转录试剂盒（MasterMix-ES、G492，镇江爱必梦生物科技有限公司）。

1.3 主要仪器 倒置荧光显微镜（M152-N，广州明美光电科技有限公司）；全波长酶标仪（Synergy 2，美国伯腾仪器有限公司）；流式细胞仪（Cyto FLEX，贝克曼库尔特国际贸易上海有限公司）；高速低温组织研磨仪（KZ-Ⅲ-F，武汉赛维尔生物科技有限公司）；台式高速冷冻离心机（D3024R，美国赛洛捷克有限公司）；全自动医用PCR 分析系统（SLAN-96S，上海宏石医疗科技有限公司）；电泳仪、转膜仪（型号分别为Power Pac Basic、Mini Trans-Blot Cell，美国伯乐生命医学产品上海有限公司）；化学发光成像系统（Chemi Scope6100，上海勤翔科学仪器有限公司）。

1.4 CCK8 法检测FAC 对MG-63 骨肉瘤细胞增殖抑制的影响 取对数生长期且密度达瓶底80%～90%的MG-63 骨肉瘤细胞，洗涤，消化，离心并重悬，取100 μL 细胞悬液（8×104个/mL）接种到96 孔板中，进行分组：给药组分别加入浓度为50、100、200、300、400 mg/L 的FAC，对照组加入等体积培养液，为排除药物及培养液本身对CCK8 比色测定OD 值的可能影响，另设置空白对照组（只含空白培养基），每组5 个复孔，分别培养24、48、72 h后，添加100 μL CCK8溶液，继续培养30 min，用酶标仪测定450 nm 波长下的光密度（OD），重复实验3 次。计算细胞存活率：细胞存活率（%）=（OD 给药组-OD 空白对照组）÷（OD 对照组-OD空白对照组）×100%；绘制细胞生存曲线；计算半数抑制浓度IC（50）。

1.5 划痕实验检测FAC 对MG-63 骨肉瘤细胞迁移修复能力的影响 调整对数生长期细胞浓度，以4×105个/mL 接种在6 孔板中，每孔接种1 mL，培养至细胞贴壁且长满板底，在细胞的中央区域划痕，PBS洗涤3次，随机分为对照组，低、中、高浓度组（100、200、300 mg/L）及阳性对照组（10 mg/L 顺铂），继续培养24 h，分别在0 h 和24 h 时显微镜下镜检拍照，重复实验3 次，用ImageJ软件计算细胞划痕面积。

1.6 FAC 对MG-63 骨肉瘤细胞的形态学影响 调整对数生长期细胞浓度，以1×105个/mL 接种在24 孔板中，每孔接种0.5 mL，培养至细胞贴壁且长满板底，同“1.5 项目”分组，每组3 个复孔，继续培养48 h，分别于0 h和48 h在光学显微镜下观察细胞形态。

1.7 Hoechst33258 染色法检测细胞凋亡情况 调整对数生长期细胞浓度，以1×105个/mL 接种在24 孔板中，每孔接种0.5 mL，培养过夜至细胞贴壁，同“1.5”分组，每组3 个复孔，继续培养48 h，PBS 洗涤2 次，无水甲醇固定3 h，PBS洗涤2次，室温下Hoechst33258染色液避光染色10 min，PBS 洗涤2 次，荧光显微镜下观察各组细胞凋亡情况。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡 调整对数生长期细胞浓度，以2×105个/mL 接种在6 孔板中，每孔接种1 mL，培养过夜至细胞贴壁，同“1.5 项目”分组，每组3 个复孔，加药后培养48 h，收集各组的培养基，以1 000 r/min 离心4 min，去上清液，根据AnnexinV/PI试剂盒说明处理细胞，1 h内流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.9 RT-PCR 检测细胞RANK、RANKL、OPG 及凋亡相关因子mRNA 的表达 调整对数生长期细胞浓度，以2×105个/mL 接种在6 孔板中，每孔接种1 mL，培养过夜至细胞贴壁，同1.5 节分组，每组3 个复孔，加药培养48 h后收集各组细胞，按照试剂盒方法提取总RNA，核酸分析仪测定浓度，每个样本取2 μg RNA，参照试剂盒说明书逆转录为cDNA，以β-Actin 为内参，按照试剂盒说明进行PCR 扩增，循环条件为：95 ℃10 min预变性，（95℃10 s，60 ℃30 s）×40个循环，目标基因的相对表达量=2-ΔΔCT。引物序列见表1。

表1 RT-PCR中的PCR反应引物

1.10 Western blotting 检测细胞RANK、RANKL、OPG及凋亡相关因子蛋白表达 调整对数生长期细胞浓度，以2×105个/mL 接种在6 孔板中，每孔接种1 mL，培养过夜至细胞贴壁，同1.5 节分组，每组3 个复孔，加药培养48 h 后收集各组细胞，加入RIPA 裂解液进行裂解，BCA 法测定蛋白浓度，取160 μL 蛋白上清，十二烷基硫酸钠—聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳分离蛋白后，转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，加入抗RANK、RANKL、OPG、Caspase-3和β-Actin 的一抗，4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤3次，加入二抗孵育1 h，TBST洗涤3次，ECL试剂盒显色，用凝胶成像系统拍照，采用Image J软件分析灰度。

1.11 统计学处理 各检测结果采用GraphPad Prism8.0.1、SPSS22.0软件进行分析，计量资料均以（±s）表示，计数资料均以“n、%”表示，组间差异比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FAC对MG-63骨肉瘤细胞的增殖抑制作用 CCK8法检测结果显示，与对照组相比，50 mg/L FAC 作用24、48 h后细胞存活率较对照组下降，但差异无统计学意义（P＞0.05），72 h时差异有统计学意义（P＜0.001）。其余不同浓度组在24、48、72 h 时细胞存活率均下降（P＜0.05，P＜0.01或P＜0.001），且药物浓度越高、作用时间越长，细胞存活率越低，呈现出明显的时间和浓度依赖趋势，给药24、48、72 h后的IC50分别为（212.200±2.13）、（135.771±25.27）、（61.930±1.26）mg/L，结果见表2、图1。

图1 FAC作用MG-63骨肉瘤细胞24、48、72 h时的半数抑制浓度（IC50）

表2 各组不同时间点骨肉瘤细胞存活率比较（%，±s）

表2 各组不同时间点骨肉瘤细胞存活率比较（%，±s）

注：与对照组比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01，***P ＜0.001。下同。

组 别对照组FAC 50 mg/L组FAC 100 mg/L组FAC 200 mg/L组FAC 300 mg/L组FAC 400 mg/L组n3 3 3 3 3 3 24 h 100.00±0.27 88.66±6.52 80.94±8.72*68.23±0.38**41.59±18.75***5.37±1.56***48 h 100.00±0.37 85.81±11.00 59.51±13.58**44.86±18.62***20.48±9.84***2.08±0.74***72 h 100.00±0.00 58.00±0.95***29.78±0.44***16.35±1.50***5.57±0.35***1.13±0.53***

2.2 FAC 对MG-63 骨肉瘤细胞迁移修复能力的影响 见图2、图3。划痕实验结果显示，对照组细胞划痕迁移修复率最高，为（42.47±0.78）%，低、中、高浓度组分别为（31.62±0.85）%、（25.38±1.18）%、（6.05±2.96）%，阳性对照组为（14.74±2.58）%。各浓度组、阳性对照组的划痕迁移修复率较对照组均降低，且划痕迁移修复率与药物浓度呈负相关，中、高浓度组及阳性对照组与对照组差异有统计学意义（P＜0.001），高浓度组较阳性对照组迁移修复率低。

图2 显微镜下不同浓度FAC作用MG-63骨肉瘤细胞0 h和24 h时的迁移修复

图3 不同浓度FAC作用MG-63骨肉瘤细胞24 h的迁移修复率

2.3 FAC 作用后MG-63 骨肉瘤细胞形态学变化 见图4。普通光学显微镜下，正常MG-63 骨肉瘤细胞为贴壁细胞，细胞形态较均一，排列整齐，为成纤维细胞状。给予FAC 药物作用48 h 后，细胞状态逐渐变差，逐渐皱缩变圆，直至从细胞培养板底部脱落，且细胞皱缩脱落数量随着药物浓度升高而增多，逐渐破裂成细胞碎片。

2.4 FAC 诱导MG-63 骨肉瘤细胞发生凋亡 见图5。Hoechst33258 荧光染色结果显示，对照组细胞核大小相近，染色均匀，呈现均一的蓝色淡染。低、中、高浓度FAC 及顺铂作用MG-63 骨肉瘤细胞48 h 后均存在细胞凋亡现象，表现出典型的凋亡细胞细胞核荧光特征，高亮蓝色浓染的细胞核，染色质固缩贴近细胞核，细胞核因凋亡而碎裂，并出现凋亡小体，且随FAC 浓度增高，MG-63 骨肉瘤细胞凋亡现象更明显，高浓度组较阳性对照组凋亡现象更强。

2.5 FAC 诱导MG-63 骨肉瘤细胞的凋亡率 见图6、图7。流式细胞术结果显示，与对照组、阳性对照组的细胞总凋亡率为7.84%、93.61%相比，低、中、高浓度FAC 作用MG-63 骨肉瘤细胞48 h 时总凋亡率分别为4.46%、8.51%、98.15%，高浓度组较对照组、阳性对照组凋亡率高，与对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。

图6 不同浓度FAC作用48 h后MG-63骨肉瘤细胞凋亡的流式图

图7 Annexin V/PI双染法流式细胞仪检测不同浓度FAC对MG-63骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用

2.6 不同浓度FAC 对MG-63 骨肉瘤细胞中RANK、RANKL、OPG 及凋亡相关因子Caspase-3 mRNA 表达的影响 见表3。RT-PCR 检测结果显示，与对照组相比，各浓度给药组、阳性对照组MG-63 骨肉瘤细胞OPG 的mRNA 表达下降，其中高浓度组与对照组差异有统计学意义（P＜0.001），高浓度组较阳性对照组表达更低。高浓度组、阳性对照组MG-63 骨肉瘤细胞中RANK、RANKL的mRNA表达升高，高浓度组差异有统计学意义（P＜0.01）。各浓度给药组、阳性对照组MG-63骨肉瘤细胞中Caspase-3 mRNA 表达明显升高（P＜0.05或P＜0.001），高浓度组表达较阳性对照组高。

表3 各组MG-63骨肉瘤细胞48 h后RANK、RANKL、OPG及Caspase-3的mRNA表达水平比较（±s）

表3 各组MG-63骨肉瘤细胞48 h后RANK、RANKL、OPG及Caspase-3的mRNA表达水平比较（±s）

组 别对照组低浓度组中浓度组高浓度组阳性对照组n3 3 3 3 3 RANK 1.00±0.12 1.64±0.41 4.19±1.27 16.79±4.67***1.74±0.37 RANKL 1.00±0.25 1.07±0.11 0.91±0.09 4.43±1.38**3.35±1.47 OPG 1.00±0.10 0.66±1.07 0.49±0.17 0.04±0.02***0.14±0.07 Caspase-3 1.00±0.03 1.65±0.36*1.71±0.10*2.94±0.48***1.79±0.29*

2.7 不同浓度FAC 对MG-63 骨肉瘤细胞中RANK、RANKL、OPG 及凋亡相关因子Caspase-3 蛋白表达的影响 见表4、图8。Western blotting 检测结果显示，与对照组相比，各浓度给药组及阳性对照组MG-63 骨肉瘤细胞中OPG 蛋白表达明显下调（P＜0.05 或P＜0.01或P＜0.001），高浓度组较阳性对照组表达更低。与对照组相比，各浓度给药组、阳性对照组MG-63 骨肉瘤细胞中RANK、RANKL 蛋白表达明显上调（P＜0.05 或P＜0.01 或P＜0.001），高浓度组均较阳性对照组表达水平高。与对照组相比，各浓度给药组MG-63 骨肉瘤细胞中Caspase-3 蛋白表达上调，中、高浓度组差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

图8 48 h后各组MG-63骨肉瘤细胞RANK、RANKL、OPG及Caspase-3蛋白表达

表4 各组MG-63骨肉瘤细胞48 h后RANK、RANKL、OPG及Caspase-3蛋白相对表达量比较（±s）

表4 各组MG-63骨肉瘤细胞48 h后RANK、RANKL、OPG及Caspase-3蛋白相对表达量比较（±s）

组别对照组低浓度组中浓度组高浓度组阳性对照组n3 3 3 3 3 RANK/β-Actin 0.16±0.04 0.33±0.06*0.61±0.13**0.79±0.12***0.59±0.12**RANKL/β-Actin 0.07±0.01 0.23±0.05**0.53±0.04***0.86±0.03***0.65±0.06***OPG/β-Actin 1.00±0.18 0.65±0.14*0.62±0.13*0.18±0.01***0.48±0.10**Caspase-3/β-Actin 0.14±0.04 0.45±0.05 0.72±0.15*1.11±0.09**0.98±0.07

3 讨 论

骨肉瘤是一种普遍且具有浸润性的骨恶性肿瘤，预后极差。经过多次化学治疗的骨肉瘤患者往往会产生耐药，耐药不仅限于使用过的化疗药物，还会造成其他多种不同化疗药物交叉耐药，对化疗药物耐药是骨肉瘤患者治疗失败的主要原因之一［13］。化疗作为骨肉瘤患者治疗的主要方式之一，耐药导致的疗效不佳是一个亟待解决的问题。现有研究已经证明，中药不仅能调节恶性肿瘤患者的身体机能，提高免疫力［14］，同时也能有效增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、逆转肿瘤细胞化疗耐药、防治肿瘤细胞远处转移［15］，部分中药甚至具有杀伤肿瘤细胞的作用［16］。

《本草衍义》［17］以“补肾药，今人多用”首次确认沙苑子补肾功效，现今亦认为沙苑子“功专补肾固精”［18］，为“肾脏气剂”［19］。已证明FAC 可抗白血病、宫颈癌、乳腺癌、肝癌等恶性肿瘤［20-24］。韦翠萍等［20］研究发现，FAC可以抑制HL-60细胞增殖，并表现出浓度及时间依赖性，其机制可能是通过提高p53 蛋白表达诱导HL-60 细胞凋亡。刘春宇等［21］实验发现，无论体内体外，FAC 对HL-60、SMMC-7721 和HeLa 细胞均有明显的抑制作用。胡延维等［22］证实，FAC 可通过下调VEGF及其受体的表达，上调ES的表达，抑制肿瘤组织血管生成，进而产生抗肿瘤作用。已证实FAC 通过诱导细胞凋亡、抑制血管生成等途径实现抗肿瘤作用，但其具体作用机制尚未完全阐明。

本实验通过采用不同浓度FAC 体外作用于MG-63骨肉瘤细胞，发现FAC可以抑制MG-63骨肉瘤细胞的增殖，但低浓度、短时间的抑制作用较弱，当达到一定浓度后（本实验提示为100 mg/L）FAC 对MG-63 骨肉瘤细胞具有明显的抑制作用，且细胞存活率与浓度呈负相关。划痕实验显示200、300 mg/L FAC 可明显抑制MG-63 骨肉瘤细胞的迁移和修复，且300 mg/L FAC 的抑制作用较10 mg/L 顺铂强。FAC 药物作用后，细胞失去了原有的成纤维细胞状形态，贴壁黏附力下降，破裂成细胞碎片，在大体上呈现出凋亡形态。Hoechst33258 荧光染色显示FAC 作用48 h 后MG-63骨肉瘤细胞表现出凋亡形态学变化，且随FAC 浓度增高，MG-63骨肉瘤细胞凋亡现象更明显，300 mg/L FAC较10 mg/L 顺铂凋亡现象明显。流式细胞仪检测Annexin V-PI 双染结果显示，300 mg/L FAC、10 mg/L 顺铂作用48 h 能明显诱导MG-63 骨肉瘤细胞发生凋亡，300 mg/L FAC较顺铂凋亡率高。

为了进一步研究FAC 诱导MG-63 骨肉瘤细胞凋亡的具体机制，本研究用PCR 法和Western blotting 法检测细胞RANK、RANKL、OPG、Caspase-3 的mRNA 和蛋白表达。Caspase 是细胞凋亡途径的关键因素［25］。RANK 是TNF 受体配体超家族成员，其配体是肿瘤坏死因子（TNF）配体超家族的RANKL，它们在破骨细胞分化、活化、成熟过程中起关键作用。OPG属于TNF受体超家族成员，是一种“圈套”受体，其与配体RANKL结合可阻断RANKL／RANK 间的相互作用，从而起到抑制破骨细胞分化、减少骨吸收的作用［26］。PCR 结果显示，FAC 作用后细胞的Caspase-3 mRNA 表达升高，RANKL 和RANK mRNA 表达也升高；相反，OPG mRNA 表达下降。Western blotting 结果显示，FAC作用后细胞的RANK、RANKL 和Caspase-3 蛋白表达升高；相反，OPG蛋白表达降低。因此本研究认为，FAC是通过RANK/RANKL/OPG 信号轴途径诱导MG-63 骨肉瘤细胞发生凋亡。

综上所述，FAC 具有抑制MG-63 骨肉瘤细胞生长，并诱导其凋亡的作用，其作用机理可能是通过下调OPG 的表达，使RANK、RANKL 和凋亡因子Caspase-3表达升高，诱导MG-63 骨肉瘤细胞发生凋亡。