大豆愈伤组织诱导及再分化的影响因素探索

何 莉, 候延宁, 唐玉林, 杜昕颖, 徐翠莲

(塔里木大学农学院, 新疆 阿拉尔 843300)

大豆体细胞胚胎发生和器官发生再生系统于20世纪80年代初期成功建立,目前虽趋于完善,但相对于其他作物,大豆组织培养体系中仍然存在再生频率较低,重复性差,基因型依赖性强等问题。在大豆组织培养的整个过程中,从外植体到愈伤组织,再到不定芽分化以及植株再生过程中,受诸多因素的影响,其中第一因素是内部因素,主要包括材料本身基因型的影响,同时合适的外植体选取同样也是大豆愈伤组织能否诱导成功的关键;其二是外部因素,即培养基的种类和激素的组合配比以及光照、温度等培养条件。培养基成分以及激素种类配比选取不同,大豆愈伤组织的诱导以及再生也会相应呈现不同的效果。培养条件对大豆组织培养的作用也不容忽视。因此,深入探索大豆组培过程中愈伤组织诱导和不定根芽再分化的影响因素,并积极寻找对策是大豆组织培养体系得以完善的关键。

1 内 因

1.1 材料本身基因型的影响

材料的基因型对愈伤组织的器官分化有决定性的影响,不同植物之间有明显差异,比如烟草、胡萝卜和矮牵牛等植物容易诱导器官的形成。而禾谷类、豆类、棉花等就比较困难。同一种植物不同品种,由于基因型差异,其诱导难易程度以及诱导频率也不同。程林梅等[1]以8种不同基因型的大豆为试验材料,研究激素浓度对大豆植株再生体系的影响发现,所有的基因型在合适的培养条件下都可以诱导愈伤组织的生成,但不同的基因型由愈伤组织诱导植株再生频率有显著差异。李换丽等[2]探究了品种对大豆再生体系的影响,选取10个大豆品种在子叶与胚尖两种不同的再生体系培养,结果同样表明,不同品种的大豆在同一再生体系有不同的诱导效果,即同一品种在不同的再生体系表现也不同。

1.2 外植体的影响

除了受基因型影响外,同一品种的不同外植体,其诱导的发生率也有差异,因此选择适合的外植体也是组培成功的关键因素。外植体对再生体系的影响,主要包括外植体本身的种类、外植体的成熟度、大小以及选取季节等方面。通常,不同种类的植物甚至同一植物的不同外植体对诱导条件反应不同,即有的部位诱导分化的成功率高,有的部位极难脱分化或再分化率很低。雷海英等[3]以晋豆19号为材料,选取子叶节、下胚轴、上胚轴、子叶、真叶等5个部位,旨在探究不同外植体的诱导效果,结果显示,下胚轴诱导效果最好,其次依次是上胚轴,子叶节、子叶和真叶,愈伤组织诱导效果依次递减,说明胚轴是比较适合的外植体。再者,外植体幼嫩程度的不同会影响外植体的灭菌率、诱导率和褐化率以及后期愈伤组织的生理状况等。年龄较幼或幼嫩的外植体,污染程度较低,细胞活力好,易于诱导形成愈伤组织,而且也容易诱导分化成植株[4]。另外,取材季节、外植体的大小与灭菌效果及存活率存在一定关联,在合适时间如生长旺季取样,试验材料的消毒效果、成活率、诱导率及增殖率往往比在生长末期取样有显著提高。过小的外植体存活率很低,而过大的则容易污染,两者均不利于诱导的成功。

2 外 因

2.1 培养基的影响

2.1.1培养基营养组分的影响

培养基是外植体赖以生存的基质。培养基的种类、营养组分以及培养基的状态等也关系着组织培养效果的好坏。用于植物细胞组培的培养基种类较多,其中MS培养基是植物组织培养中最常用的培养基,B5培养基是基于大豆根尖细胞培养而设计的培养基。这两种培养基在大豆组织培养过程中较常用。离体培养和正常植株生长过程同样需要齐全的营养,培养基中的大量元素、微量元素、铁盐和有机物等四大类物质会给外植体提供生长发育所需的营养,如果缺乏某种元素,同样会出现缺素症状或培养效果差。

培养基的状态也对培养效果产生一定影响。通常,植物细胞培养和原生质体培养常用液体培养基,而器官的培养绝大部分常用固体培养基。琼脂作为固体培养基常用的固化剂,其用量对培养效果也有一定影响,用量大则培养基透性较差,养分和激素的扩散速度慢,外植体无法及时获取养分和生理活性物质而受到抑制,同时代谢产生的废物不能很好地扩散。若琼脂用量过低,培养基凝固性差,不利于无菌操作的进行,同时也会增加培养瓶内的湿度而容易产生“玻璃化苗”而导致培养效果不佳[5]。此外,培养过程中对培养基的酸碱度和渗透压也有较为严格的要求[5]。

2.1.2培养基中激素组合与配比的影响

培养基的组成成分供给植物细胞生长所需的营养,而植物生长调节剂(激素)则决定着细胞发育的方向。接种的外植体在激素的诱导下形成愈伤组织,是大豆组织培养的第一步,愈伤组织诱导的质量对于大豆植株再生起着关键作用。不同种类的激素组合和配比对大豆愈伤组织的诱导效果有显著差异。对大豆子叶形成愈伤组织的研究结果表明,所加激素均能诱导形成愈伤组织,但不同激素种类诱导愈伤有差异,以MS添加2 mg/L 2,4-D+1 mg/L KT效果最好[6]。因此,通常情况下,几乎所有的大豆基因型材料都能诱导出愈伤组织,但是愈伤组织的进一步分化存在着一定的困难,在愈伤组织再分化及植株再生过程中,起决定性作用的依然是生长素类激素和细胞分裂素类激素的种类组合及浓度配比。愈伤组织分化根和芽与培养基中的生长素和细胞分裂素的相对浓度有关,当生长素/细胞分裂素比值高时,促进根的分化;比值低时则促进芽的分化;而当两者平衡时则会一直处于愈伤组织状态。因此,探索最适的激素配比是组织培养成功的关键。为此,大量研究人员针对大豆子叶节[7-10]、叶柄[11]以及胚尖[12-13]再生体系进行了探讨。其中,刘思言等[9]以吉农28、吉农27、吉农17三个基因型大豆子叶节作为外植体进行植株再生的研究,结果表明,适合大豆子叶节不定芽诱导的最佳培养基是MS+3 mg/L 6-BA。适合大豆子叶节不定芽增殖的最佳增殖培养基是MS+1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+31 mg/L GA。郭阳鑫等[11]建立了大豆叶柄外植体的离体再生体系,研究结果表明,叶柄愈伤组织形成的适宜培养基为改良MS+2 mg/L NAA,不定芽分化的适宜培养基为改良MS+2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA,不定根诱导的最适培养基为1/2改良MS+0.8 mg/L IBA。胡润芳[12]对菜用大豆胚尖转化再生体系进行了优化研究;闫帆等[13]对大豆胚尖再生体系建立的结果表明,6-BA对不定芽再生作用显著,单独使用或配合IBA使用均可获得较高的再生率。

2.2 培养条件

2.2.1光的影响

在植物组织培养的愈伤组织诱导阶段,一般因植物种类不同通常采用全暗、周期性光照、散射性光照3种做法,大豆愈伤组织诱导采用散射性光照比较好;而在器官发生阶段,则一般给予周期性光照比较好。多数植物最常用的光周期是光照16 h,黑暗8 h。除此之外,光照强度影响外植体细胞的增殖,组织和器官的分化,因此不同植物对光照强度也有不同要求。大豆在体细胞胚胎发生诱导过程中对光照的要求不太严格,可以是黑暗,也可以采用12～24 h光照,光照强度的变化范围也较宽,在50～6 000 lx之间[14]。

2.2.2温度的影响

植物离体材料培养的最适温度为(25±2)℃,而且对于多数植物的离体培养通常均采用恒温培养即可较好地完成不定芽和植株再生等过程,大豆离体材料培养的温度控制在25 ℃左右即可。

但也有资料表明,温度高低对器官发生的数量和质量仍有影响。如对禾本科、兰科等的喜温性植物的培养温度可上调1～2 ℃,控制在26～28 ℃比较适宜。而对于十字花科、菊科等喜凉性植物的培养温度可向下微调,控制在25 ℃以下,20 ℃以上较为适宜。