去铁胺促进亚致死剂量X射线辐照小鼠的骨髓造血功能恢复

张小敏，吴泽彬，蓝惠璇，陈姗姗，吴 杰，3，朱玲玲，3，肖 扬，4

1广州中医药大学金沙洲医院，血液科，广东 广州 510168；2南方医科大学中医药学院，广东 广州 510515；3南方医科大学中西医结合医院血液科，广东 广州 510000；4深圳市前海蛇口自贸区医院血液科，广东 深圳518067

放射治疗是治疗腹、盆腔恶性肿瘤的有效方法之一［1,2］，然而它也是一把双刃剑，在杀伤肿瘤细胞的同时，它也会损伤邻近的健康组织，尤其是增殖、更新较快的组织及器官，如骨髓及淋巴器官等。当机体暴露于全身亚致死剂量辐照（TBI）后，体内水分子快速分解，并产生活性氧（ROS）和活性氮（RNS）等自由基［3］，进而导致组织出现氮氧应激损伤，甚至激活Caspase凋亡等信号通路［4-7］，导致骨髓造血受损［8］。然而防治辐照诱导的骨髓损伤,尚未取得令人满意的成果［9］。因此，亟需探索有效的药物来预防或减轻辐照诱导的骨髓损伤。

去铁胺（DFO）是一种临床上常用的铁离子螯合剂，主要用于治疗输血依耐性铁过载［10］，如地中海贫血、骨髓增生异常综合征、再生障碍性贫血患者等反复输血所出现的慢性铁过载［11,12］，同时它能改善患者血象、减少输血依赖［13］，并提高患者外周造血祖细胞计数［14］。现代研究证实它还具有多种药理学作用，如促进血管生成、抑制凋亡、抗氮氧应激、调节免疫、促进造血干细胞植入等作用［15-19］。此外，研究发现DFO也是一种有效的铁死亡抑制剂，能够减轻多种由铁死亡介导的组织损伤［20,21］。因而，DFO在促进组织修复方面表现出巨大潜力［15,22］，并且相关研究发现它能够缓解苯暴露后小鼠骨髓造血损伤［23］。然而，DFO能否改善亚致死剂量辐照所介导的骨髓造血受损尚未见研究报道。因此，本实验旨在探讨DFO对亚致死剂量X射线辐照小鼠骨髓造血功能的影响，为机体辐照暴露后骨髓抑制提供一种新的防治策略。

1 材料和方法

1.1 实验试剂及仪器

DFO（Novartis）；红细胞裂解液（Biolegend）；4%多聚甲醛固定液（biosharp）；PBS缓冲液（Solarbio）；anti-CD34-PE（Biolegend）；GAPDH（CST）；cleaved PARP-1（CST）；cleaved caspase-3（CST）；VEGFA（Abcam）；GPX4（Abcam）；SLC7A11（Abcam）；Goat Alexa Flour 594（Thermo Scientific）；anti-CD34-PE（Biolegend）；辐照仪（Multi Rad）；血细胞计数仪（迈瑞BC-5000全自动血细胞分析仪）；石蜡包埋机（Leica）；轮转石蜡切片机（Leica）；IX 53型正置荧光光学显微镜（Olympus）；电泳仪（Bio-radMini-Sub Cell）；流式细胞仪（Beckman）；Fluor ChemE超灵敏全自动成像仪（Cell Biosciences）。

1.2 实验动物及分组

30只SPF级8周龄雌性C57BL/6小鼠（体质量18～20 g），购自广东省医学实验动物中心，合格证号：SCXK（粤）2022-0002，饲养于南方医科大学实验动物中心SPF级动物房内。按随机数字表法，将C57BL/6小鼠分为空白对照组（Control 组）、全身亚致死剂量辐照组（TBI组）、DFO治疗组（DFO组），每组各10只。DFO治疗组小鼠每天皮下注射给予100 mg·kg-1DFO溶液，从辐照后第1天开始给药，空白对照组和TBI组小鼠每天皮下注射等量生理盐水。辐照后第10天随机处理5只小鼠，进行血细胞计数、骨髓有核细胞计数及骨髓病理检测，采用流式细胞术检测骨髓中CD34+细胞比例，并检测凋亡、铁死亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved PARP-1、GPX4、SLC7A11及VEGF表达；在辐照后第20天处理各组剩余5只小鼠，进行血细胞计数、骨髓有核细胞计数及骨髓病理检测。本实验经南方医科大学伦理会委员会批准，伦理编号（L2020074）。

1.3 一般情况监测、血细胞计数检测与骨髓有核细胞计数

每天观察各组小鼠的一般状况，如精神活动、饮食等，每隔2 d及处死当天称量并记录小鼠体质量。在辐照后第10、20天，各组分别随机处理5只小鼠。采用摘眼球取血法收集外周血于EDTA抗凝管中，取0.1 mL外周血用于全自动细胞分析仪检测外周血细胞中白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）、血小板（PLT）计数。取双侧股骨，用5 mL注射器抽取预冷PBS缓冲液反复冲洗骨髓腔，直至股骨发白，收集骨髓细胞悬液，裂解红细胞后计数骨髓有核细胞（BMNCs）数目。

1.4 骨髓病理学检查

取小鼠胸骨于脱钙液中浸泡2 d，至胸骨完全软化，再于自来水中浸泡2 h，经不同浓度酒精梯度脱水、浸蜡包埋及切片处理后，进行苏木精/伊红染色，待切片风干后，在普通光学显微镜下观察各组骨髓病理变化及拍片，并进行病理评估。

1.5 流式细胞术检测骨髓CD34+细胞比例

在辐照后第10天处理小鼠，收集骨髓细胞悬液，裂解红细胞后，取1×106个骨髓有核细胞，每个样品离心重悬至100 μL，按照流式抗体说明书每管样品加入1μL anti-CD34-PE 流式抗体，4 ℃、避光孵育30 min；加入1 mL PBS终止抗体孵育，经800 r/min、5 min离心，弃上清液；再加入300 μL PBS重悬细胞，采用流式细胞仪检测各组小鼠骨髓中CD34+细胞比例。

1.6 Western blotting 检测小鼠骨髓cleaved PARP-1、cleaved caspase-3、GPX4、SLC7A11和VEGF蛋白表达

取各组小鼠剩余骨髓有核细胞悬液，经4 ℃、1000 r/min 离心5 min，弃上清，留取细胞沉淀，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，经4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液，采用BCA蛋白定量试剂盒检测骨髓蛋白浓度，蛋白变性后各取40 μg 蛋白进行SDSPAGE电泳，转膜至PVDF膜，剪切目标蛋白条带，滴加cleaved PARP-1、cleaved caspase-3、GPX4、SLC7A11及VEGF一抗稀释液（1:1000）充分覆盖PVDF膜，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后4 ℃孵育二抗2 h，再次TBST洗膜，经ECL显色后，采用Fluor ChemE超灵敏全自动成像仪进行曝光显影，并采用Image J软件进行条带灰度分析。

1.7 免疫组化检测骨髓中cleaved caspase-3蛋白表达

取小鼠胸骨石蜡切片置于60 ℃烤箱中烤片0.5 h，然后脱蜡复水并在微波炉中热修复抗原后，采用3%过氧化氢溶液中灭活内源性过氧化物酶及并用BSA常温封闭2 h。然后滴加一抗cleaved caspase-3（1∶200），4 ℃冰箱中孵育过夜；室温下复温5 min并经洗片后，滴加二抗辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶500）常温孵育2 h，DAB显色5～10 min，于显微镜下观察显色情况并终止，然后采用苏木素复染和中性树胶封片，待片子风干后于正置普通光学显微镜下拍片。结果判定：胞浆呈棕黄色为阳性表达。应用Image J图像处理软件计算平均光密度来分析cleaved caspase-3表达情况。

1.8 免疫荧光法检测骨髓微环境中VEGF表达

将经脱钙和固定后的胸骨，置于30%蔗糖溶液中脱水，直至下沉后采用OTC胶包埋，进行冰冻切片，切片厚度为4 μm。采用画圈笔画圈，切片组织经山羊血清封闭1 h后加入一抗VEGF（1∶200），4 ℃孵育过夜；再经Alexa Flour 594荧光标记山羊抗小鼠Ig G抗体（1∶500）于37 ℃孵育30 min后，经DAPI溶液染核后，滴加防猝灭剂并进行封片，于正置荧光显微镜下观察并拍片。

1.9 统计学处理

采用SPSS 22.0统计软件进行数据统计，实验数据用均数±标准差表示。若符合正态分布，采用单向方差分析（one-way ANOVA）进行组间比较；若不符合正态分布，则采用非参数检验；用GraphPad Prism 5软件作图。P<0.05代表差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况

自第2天起TBI组及DFO组小鼠陆续出现倦怠、活动减少及体质量下降；自第7天起TBI组及DFO组小鼠活动较前增加，体质量开始恢复。在亚致死剂量辐照之前，各组小鼠体质量无明显差异（P>0.05）。在亚致死剂量辐照后，与空白对照组相比，TBI组及DFO组小鼠体质量在第3天明显降低（P<0.05），第6天TBI组小鼠体质量降至最低（P<0.01）；与TBI组相比，DFO组小鼠体质量出现一定程度增加，但不具有统计学差异（P>0.05，图1）。

图1 各组小鼠体质量变化Fig.1 Body weight changes of the mice in each group.*P<0.05,**P<0.01 vs control.

2.2 各组小鼠血细胞计数与骨髓有核细胞计数情况

与空白对照组相比，在辐照后第10 天和第20 天TBI组小鼠外周血WBC、RBC、HGB、PLT及BMNCs水平均明显下降（P<0.01或P<0.001），在辐照后第10天和第20天DFO组小鼠WBC、PLT及BMNCs数目也出现不同程度的下降（P<0.01 或P<0.001）；与TBI 组相比较，在辐照后第10天DFO组小鼠外周血RBC、PLT及BMNCs水平明显升高（P<0.05），在辐照后第20天DFO组小鼠外周血WBC、PLT及BMNCs水平都显著升高（P<0.01），而RBC计数明显增加（P<0.05，表1）。

表1 各组小鼠外周血WBC、RBC、HGB、PLT及骨髓BMNCs 水平Tab.1 Peripheral blood levels of WBC,RBC,HGB,PLT and BMNCs in each group at 10 and 20 days after TBI

2.3 各组小鼠骨髓病理特点

骨髓HE染色显示，空白对照组小鼠骨髓中造血组织结构完整，造血细胞增殖旺盛；TBI组和DFO组小鼠骨髓造血组织明显减少，主要表现为骨髓有核细胞减少，及出现脂肪空泡等，其中以第10天表现较为明显；与TBI组相比，DFO组小鼠骨髓损伤相对较轻，骨髓有核细胞明显增加，脂肪空泡数量相对减小；但是随着观察时间的延长，TBI组和DFO组小鼠骨髓有核细胞都逐渐增加，骨髓病理损伤较前减轻（图2A），并且未见明显的肝脾毒性（图2B）。

图2 各组小鼠骨髓及肝脾病理变化Fig.2 Pathology of the bone marrow,liver and spleen in each group(HE staining,original magnification:×400).A:Pathology of bone marrow in each group.B:Pathology of liver and spleen in each group.

2.4 各组小鼠骨髓CD34+细胞比例

在辐照10 d后检测各组小鼠骨髓中CD34+细胞比例，流式细胞术结果显示与空白对照组相比，TBI组小鼠骨髓中CD34+细胞比例降低，但无明显统计学差异（P>0.05）；与TBI组相比，DFO组小鼠骨髓中CD34+细胞比例显著增加（P<0.001，图3）。

图3 各组小鼠骨髓CD34+细胞比例Fig.3 Percentages of CD34+ cells in the bone marrow in each group.###P<0.001 vs control;***P<0.001 vs TBI.

2.5 各组小鼠骨髓有核细胞中凋亡及铁死亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved PARP-1、GPX4、SLC7A11的表达

Western blotting结果显示，在辐照后第10天TBI组小鼠骨髓有核细胞中及铁死亡相关蛋白cleaved caspase-3、cleaved PARP-1表达较空白对照组明显增加（P<0.01）；与TBI组相比，DFO组小鼠骨髓有核细胞中cleaved PARP-1、cleaved caspase-3蛋白表达明显减少（P<0.05，图4A）；并且免疫组化结果显示，与空白对照组相比，在辐照后第10天TBI组小鼠骨髓有核细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase-3显著增加，经DFO治疗后cleaved caspase-3表达明显减少（图4B）。此外，Western blotting结果显示，在辐照后第10天TBI组小鼠骨髓有核细胞中GPX4、SLC7A11表达较空白对照组明显减少（P<0.05），与TBI组相比，DFO组小鼠骨髓有核细胞中GPX4、SLC7A11 蛋白表达明显增加（P<0.05，图5）。

图4 骨髓有核细胞中cleaved PARP-1、cleaved caspase-3蛋白的表达Fig.4 Expression of cleaved PARP-1 and cleaved caspase-3 in bone marrow nucleated cells(immunohistochemical staining:×400).A:Expressions of cleaved PARP-1,cleaved caspase-3 in bone marrow nucleated cells detected by Western blotting.B:Expression of cleaved caspase-3 in bone marrow detected by immunohistochemistry.#P<0.05,##P<0.01 vs control;*P<0.05 vs TBI.

图5 骨髓有核细胞中GPX4、SLC7A11蛋白的表达Fig.5 Expression of GPX4 and SLC7A11 in bone marrow nucleated cells.#P<0.05,##P<0.01 vs control;*P<0.05 vs TBI.

2.6 各组小鼠骨髓微环境中VEGF的表达

Western blotting及免疫荧光结果显示，与空白对照组相比，在辐照后第10天TBI组小鼠骨髓VEGF表达明显减少（P<0.05）；与TBI组相比，DFO组小鼠骨髓微环境中VEGF蛋白表达明显增加（P<0.05，图6）。

图6 骨髓微环境中VEGF的表达Fig.6 Expression of VEGF in the bone marrow microenvironment(immunofluorescence staining,×200).A:Expression of VEGF in bone marrow detected by Western blotting.B: Expression of VEGF in bone marrow detected by immunofluorescence.#P<0.05 vs control;*P<0.05 vs TBI.

3 讨论

由于淋巴造血系统对电离辐射具有高度的敏感性，辐射暴露极易导致骨髓造血细胞氧化应激损伤及凋亡［24,25］，从而导致骨髓抑制的发生［26-28］，并降低肿瘤患者对治疗的耐受性及生活质量，故防治机体辐射暴露后骨髓造血功能抑制具有重要的临床应用价值。现代研究发现铁离子螯合剂DFO能够通过抗氧化应激、抑制凋亡、抑制铁死亡及促进血管生成等多种方式促进组织损伤修复。因此，在本研究探究了DFO对亚致死剂量X射线辐照小鼠骨髓造血功能的影响，拟进一步拓展DFO的临床应用。研究结果显示，亚致死剂量辐照后小鼠外周血三系细胞、BMNCs数量及小鼠体质量均出现下降，其中WBC、PLT及BMNCs数目减少尤为明显，与其他文献报道一致［27,29］，并且骨髓病理显示亚致死剂量辐照后小鼠骨髓造血组织明显减少及出现脂肪空泡等非造血组织，以上提示亚致死剂量辐照后小鼠骨髓造血功能受损。经DFO治疗后，亚致死剂量辐照小鼠外周血细胞计数和BMNCs计数明显增加，骨髓有核细胞数量及造血组织增加；并且经DFO治疗10 d后亚致死剂量辐照小鼠骨髓中CD34+细胞显著增加，在临床上CD34+细胞计数可作为反映骨髓造血功能的的可靠指标［30］，并且常用于评估造血干细胞移植时所采集的骨髓造血干/祖细胞（HSPCs）数量及移植患者骨髓造血功能重建等，以上提示DFO可明显改善亚致死剂量辐照小鼠骨髓造血功能。然而随着观察时间的延长，亚致死剂量辐照组小鼠的体质量、外周血细胞计数及BMNCs逐渐上升，提示亚致死剂量辐照小鼠的骨髓造血功能可逐渐恢复，而DFO可进一步促进亚致死剂量辐照小鼠造血功能恢复。

在本实验中，亚致死剂量辐照小鼠骨髓有核细胞中凋亡相关蛋白cleaved PARP-1、cleaved caspase-3表达明显增加，说明亚致死剂量辐照可通过激活骨髓有核细胞中caspase凋亡信号通路［31］；而给予DFO治疗后，亚致死剂量辐照小鼠骨髓有核细胞中cleaved PARP-1、cleaved caspase-3表达明显降低，提示DFO可能通过抑制骨髓有核细胞凋亡来减轻亚致死剂量辐照小鼠骨髓造血功能受损。然而，由于射线辐照不仅可以诱导骨髓有核细胞凋亡，还可导致铁死亡发生［20,32,33］，因此在该研究中我们也探究了DFO是否通过抑制骨髓造血细胞铁死亡来改善亚致死剂量辐照所导致的骨髓造血功能受损。铁死亡是程序性细胞死亡的重要形式之一，由铁稳态紊乱和不受限制的脂质过氧化所介导，并广泛参与多种疾病的发生。GPX4和SLC7A11是铁死亡的抑制因子。在我们的研究中，亚致死剂量辐照小鼠骨髓有核细胞中GPX4、SLC7A11蛋白表达明显减少，说明亚致死剂量辐照可促进骨髓有核细胞中铁死亡［31］；而给予DFO治疗后，亚致死剂量辐照小鼠骨髓有核细胞中GPX4、SLC7A11蛋白表达明显增加，提示DFO可抑制亚致死剂量辐照小鼠骨髓中有核细胞铁死亡。

此外，在骨髓微环境中微血管分布广泛，可为骨髓造血干/祖细胞输运多种营养物质并促进骨髓造血干/祖细胞增殖和发育。因此，骨髓造血与骨髓微血管的生成密切相关。VEGF作为一种重要的血管生成因子，在正常小鼠骨髓细胞中大量表达并参与骨髓造血干/祖细胞的增殖［34］；并且相关文献报道DFO可促进脑缺血组织中VEGF的表达并诱导新生血管生成［35］。因此，在本研究中我们也进一步探究了DFO对亚致死剂量辐照小鼠骨髓微环境中VEGF表达的影响。在我们研究中发现亚致死剂量辐照小鼠骨髓中VEGF蛋白表达明显减少；而经DFO干预后，小鼠骨髓中VEGF表达增加，提示DFO也可能通过增加骨髓微环境中VEGF表达来促进骨髓造血功能恢复。

综上所述，本研究表明DFO可促进亚致死剂量X射线辐照小鼠骨髓造血功能恢复，其机制可能与抑制骨髓有核细胞凋亡和铁死亡、促进骨髓微环境中VEGF表达及CD34+细胞增殖有关，并可为机体辐射暴露后骨髓抑制提供一种新的防治策略。