围产期氟摄入对子代小鼠肝功能的影响

张佳慧 陈诗琪 丁 斓 周 平 翟晓虎 贺卫华＊

（1.江苏农牧科技职业学院 江苏泰州 225300；2.上海睿金宠物诊所 上海 201508）

氟是一种非金属卤素， 是人类生命活动必需的微量元素之一， 广泛存在于自然环境中。 长期摄入高剂量的氟化物会导致氟中毒， 该病是一种慢性中毒性疾病。 氟中毒不仅会侵害机体的牙齿、骨骼，导致氟斑牙、氟骨症等，而且还会对非骨相器官组织，如肝脏、脾脏、肾脏、胃肠道、脑、中枢神经系统、甲状腺等造成广泛性损伤[1-4]。 氟中毒会引起肝脏发生退行性病变，光镜下可见索状肝细胞、疏松的细胞浆结构；电镜下可见肝细胞变形、细胞核膜褶皱、固缩，核仁边集等，引起局部区域肝细胞变性、坏死等[5]；当肝脏细胞受损时， 肝脏转氨酶如天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）的含量会随着受损程度的加深而不断升高。

本研究通过给围产期小鼠饮用添加了氟化钠的蒸馏水建立氟中毒动物模型， 使用HE 染色观察子代小鼠肝脏细胞的形态结构，同时通过ELISA 法检测血清中AST 和ALT，旨在为研究围产期氟摄入对子代小鼠肝脏损伤的影响提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 ALT (南京建成生物工程研究所)；AST(南京建成生物工程研究所)；0.01M 枸橼酸盐缓冲液；30% H2O2溶液；粘附载玻片；氟化钠；蒸馏水；乙醇；二甲苯等常规实验室药品。

1.2 试验动物 怀孕昆明小鼠48 只， 由山西医科大学实验动物中心提供，均为普通级动物。小鼠饲料为标准颗粒饲料，由实验动物中心配制提供。

1.3 试验方法

1.3.1 动物模型的建立 将48 只怀孕昆明小鼠随机分为四组饲养，即：对照组（A 组）、低氟组（B 组）、中氟组（C 组）、高氟组（D 组）。 对照组（A 组）供给蒸馏水，低氟组（B 组）供给含25 mg/L 氟化钠的蒸馏水，中氟组（C 组）供给含50 mg/L 氟化钠的蒸馏水，高氟组（D 组）供给含100 mg/L 氟化钠的蒸馏水。 直到母鼠分娩21 d 后， 每组随机选取雄仔鼠6 只，断颈处死采血， 采集的血液室温静置2 h 后3 000 r/min离心10 min，取上层血清，置-20 ℃冰箱保存备用，用于转氨酶测定；摘取肝脏，以4 %多聚甲醛固定，4 ℃保存。

1.3.2 肝脏组织石蜡切片制作 肝脏组织在4%多聚甲醛中固定约24 h 后，取出组织进行修块，并转移到75%酒精中过夜，置于梯度酒精中脱水，并用二甲苯透明，在石蜡中完成浸蜡与包埋。 之后，在切片机上将组织切成5 μm 薄片，在37 ℃摊片机中摊片，60 ℃烤片。

1.3.3 HE 染色 将制备好的石蜡切片置于二甲苯中脱蜡，梯度酒精脱水，苏木精染细胞核3 min、盐酸乙醇分化30 s、伊红倒进倒出，用中性树脂封固。干燥后，在生物显微镜下观察肝脏组织结构的变化。1.3.4 ALT 和AST 的测定 断颈处死小鼠， 采血、分离血清， 根据ALT 和AST 试剂盒的操作流程，利用全波长多功能酶标仪检测血清中ALT 和AST 的含量。

1.4 数据统计 应用统计学软件Graph pad Prism6.0 进行方差分析。测定数据用平均值±标准误表示；* 表示差异显著（P<0.05），** 表示差异极显著（P<0.01）。

2 结 果

2.1 肝脏组织切片观察 由图1 可知， 对照组（A）小鼠肝脏组织结构紧密， 肝小叶紧凑有秩； 低氟组（B）局部区域肝细胞坏死，肝窦有充血肿胀且空腔变大，胞浆结构疏松；中氟组（C）和高氟组（D）肝细胞局部坏死、细胞核溶解，肝窦叶间静脉淤血，细胞排列紊乱。

2.2 血清ALT 和AST 测定结果 由表1 可知，血清ALT 和AST 测定结果显示，中氟组和高氟组小鼠血清中ALT 和AST 的含量均分别极显著高于对照组（P<0.01），表明肝细胞的功能受到了严重损害。

表1 ALT、AST 含量测定结果

结果表明，与对照组相比，中氟组和高氟组肝细胞局部坏死、细胞核溶解，肝窦叶间静脉淤血，细胞排列紊乱；血清中AST、ALT 含量均极显著升高（P<0.01）。 因此，围产期氟摄入可造成子代小鼠肝脏组织发生退行性病变和肝脏受损。

3 讨 论

肝脏是动物机体重要的解毒场所， 是体内最大的消化腺，具有解毒、代谢、分泌胆汁、免疫防御等多种功能[6]。 在氟中毒大鼠肝细胞凋亡的研究中发现，氟化物的毒性可导致肝细胞凋亡[7]。 氟中毒导致小鼠肝脏组织结构病变和肝功能受损的研究报道很多， 但是围产期氟摄入对子代小鼠肝脏结构和肝功能有无影响、影响有多大鲜有报道。本试验观察到中氟组和高氟组仔鼠肝脏的结构发生了明显的病理变化，甚至出现肝细胞局部坏死、细胞核溶解等病变。同时ALT 和AST 含量极显著高于对照组，肝脏功能受损严重，且随着试验组氟含量的不断升高，肝脏损伤加重。试验表明，围产期摄入的氟可以通过胎盘屏障到达胎儿体内，对胎儿的肝脏造成不良影响，同时也为研究人氟摄入对子代健康成长的影响提供一定的理论依据。