猪繁殖与呼吸综合征病毒培养工艺的优化

张永香 兆丰华生物科技（福州）有限公司 福州 350014

猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统性的高度接触性传染病。 临床上主要表现为妊娠母猪的繁殖障碍和各个年龄段猪只的呼吸道疾病，并导致仔猪死亡率升高，生长发育受阻，高死亡率，既能垂直传播又能水平传播[1-2]，疫苗免疫接种是预防该病的主要措施之一。 对于疫苗生产企业， 提高病毒滴度和提升疫苗的产能是一个极其重要的目标。 而猪繁殖与呼吸综合征病毒（CH-1a 株）在Marc-145 细胞中培养大多数采用的是单次的接种与收获，且病毒的培养需要添加一定量的血清，使得疫苗的产能和品质都受到一定程度的限制。

本研究在猪繁殖与呼吸综合征病毒 （CH-1a株）传统培养工艺单次接种收获的基础上，采用高度敏感的Marc-145 克隆细胞株培养病毒， 通过优化维持液中不同pH 值、 不同血清浓度等培养关键技术以提高病毒滴度和降低临床副反应的发生， 同时对接毒收获工艺进行优化以增加病毒的收次， 为提高疫苗的产品品质和增加产能提供参考。

1 材 料

1.1 细胞与种毒 Marc-145 克隆细胞株与PRRSV（CH-1a 株）种毒均由兆丰华生物科技（福州）有限公司保存。

1.2 主要耗材 DMEM 培养基、胰蛋白酶，均购自GIBCO 公司；新生牛血清，购自呼和浩特市草原绿野生物工程材料有限公司；96 孔细胞板， 购自美国Corning 公司；国产15 L 细胞培养玻璃转瓶，购自江苏海门市天龙实验器材厂；Perfect Start Green qPCR Super Mix、RNA viral kit，购自Omega 公司；AMV 反转录酶、Random primer、DL2000 DNA marker 和d NTPs（2.5 mmol/L），均购自宝生物工程（大连）有限公司；PCR Master Mix（2×），购自天根生化科技有限公司。

1.3 主要仪器 倒置显微镜为37XB 公司生产；pHS-3C pH 计为雷磁公司产品；二氧化碳培养箱为三洋公司产品。

2 方 法

2.1 在不同pH 值维持液中培养 待15 L 转瓶细胞长成致密单层后， 弃去培养液加入等量的含2%病毒液的维持液。 维持液pH 分别为7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.2、8.5，置37 ℃洁净温室培养。

2.2 在不同血清浓度维持液中培养 待15 L 转瓶细胞长成致密单层后， 弃去培养液加入等量的含2%病毒液的维持液。维持液中血清浓度分别为0%、1%、2%，置37 ℃洁净温室培养。 做3 个平行重复试验，结果取3 次的平均值。

2.3 病毒在Marc-145 克隆细胞上的产毒曲线 待15 L 转瓶细胞长成致密单层后，弃去培养液加入等量的含2%病毒液的维持液， 对维持液中无血清培养进行产毒曲线绘制。

2.4 产毒工艺优化方案 根据PRRSV（CH-1a 株）在Marc-145 细胞上转瓶的产毒特性进行工艺优化。正常生产工艺在细胞接毒后只进行一次收获，而本试验尝试进行连续两次收获， 即病毒培养24～28 h 左右收获一次，然后添加相应量的维持液继续进行培养，直至细胞病变达70%～80%进行第二次收获。 每组做3 个平行重复试验， 结果取3 次的平均值。 试验方案与分组见表1。

表1 不同优化工艺方案

2.5 病毒滴度测定 用含1%血清维持液的DMEM将待测样品进行10 倍系列稀释至10-8，对8 个稀释度接种至长满单层Marc-145 克隆细胞的96 孔板中。 同时设未接毒的细胞作为阴性对照， 按Reed-Muench 法计算TCID50。

3 结果与分析

3.1 不同pH 对Marc-145 克隆细胞培养病毒增殖的影响 Marc-145 细胞培养最适pH 为7.0～7.3，其中pH7.2 为最佳[3]。 而对PRRSV 的增殖，维持液pH7.8～8.2 时收获的病毒液滴度最高，见图1。 这可能与接种时Marc-145 克隆细胞状态有关， 接毒时致密的Marc-145 克隆细胞本身易产生酸性代谢产物。

图1 维持液中不同pH 对Marc-145 克隆细胞培养病毒滴度的影响

3.2 维持液中不同血清浓度对病毒增殖的影响在0%血清浓度维持液中接毒培养20 h 时， 病毒含量可达7.69lgTCID50/mL，培养至44 h 病毒含量可达8.28lgTCID50/mL， 与1%血清培养44 h 时的病毒含量接近， 说明该病毒在Marc-145 细胞上的培养可实现无血清培养。 在1%血清浓度维持液中接毒培养24 h 后， 病毒滴度增长快且很快达到最高值，而在2%血清浓度维持液中病毒增殖和释放相对较慢， 说明维持液中1%血清浓度比较适合该病毒的培养。 见表2。

表2 维持液中血清浓度对病毒增殖的影响

3.3 病毒在Marc-145 克隆细胞上的产毒曲线 产毒曲线绘制试验， 维持液中不含血清。 从产毒曲线可知（见图2），病毒含量维持较高水平的时间段是在接毒后24～44 h，可维持20 h 左右，且Marc-145克隆细胞在接毒后24～28 h 未见明显病变细胞脱落，这为实现病毒的多次收获提供参考依据。

图2 PRRSV 在Marc-145 克隆细胞上的产毒曲线

3.4 产毒工艺优化效果3.4.1 优化前后病毒滴度 维持液中无血清培养，24～28 h 更换维持液后一收、 二收的混合液病毒滴度与原液病毒滴度差异不大。 一收时的全换液与换2/3 液体，其二收时病毒滴度未见明显差异，说明一收时可实现全换液（见表3）。

表3 优化前后病毒滴度

3.4.2 优化前后病毒载量检测 优化前后病毒载量与病毒滴度呈正相关，且优化前（A 组）的原液病毒载量与优化后（B 组、C 组）的混合液病毒载量差异不大。B 组、C 组一收时的病毒载量与A 组原液的病毒载量差异不大，说明PRRSV 在Marc-145 克隆细胞上培养达到一定量后， 其病毒核酸的降解与产生是一个动态平衡的过程（见表4）。

表4 优化前后病毒载量检测结果

4 讨 论

从PRRSV 在Marc-145 克隆细胞上的优化培养工艺看， 较高的牛血清浓度对PRRSV 在Marc-145 克隆细胞上的增殖不具有正向促进作用。 为了提高病毒滴度，应严格控制培养液中血清的含量。从PRRSV 在Marc-145 克隆细胞上有血清与无血清培养结果对比来看， 无血清培养的病毒滴度也能满足产业化生产的需求， 并且还能最大程度降低疫苗中的血清蛋白， 后期还可尝试使用无血清培养基进一步提高病毒的滴度。 试验还表明维持液不同pH 值对PRRSV 在Marc-145 克隆细胞上的增殖也有较大的影响，维持液pH7.8～8.2 有利于病毒的增殖，这可能与接种时致密的Marc-145 克隆细胞产生大量代谢产物有关。

从产毒工艺优化结果看，24～28 h 换液的不管是全换液还是2/3 换液的其病毒含量和病毒载量差异不显著。 同时，从病毒载量结果看，B 组、C 组接毒后24～28h 的病毒载量与A 组原液病毒载量相比差异不大，说明PRRSV 在Marc-145 克隆细胞上达到一定量后， 其病毒核酸的降解与产生是一个动态平衡的过程。 是否预示着整个完整的病毒粒子也与核酸一样，其降解与产生是一个动态平衡过程，需用更加准确的检测方法进行验证。 从工艺优化的病毒滴度与病毒载量看， 在产业化生产时可以直接采用全换液的方式，不仅增加了一倍的病毒液收获量，而且还便于操作。