基于网络药理学和生物信息学的大柴胡汤治疗2型糖尿病作用机制探讨

孙昊,马平,崔楠,于庆潭,崔静

(1 海军青岛特勤疗养中心医训部,山东 青岛 266071; 2 青岛市第三人民医院麻醉科; 3 青岛大学附属医院医院管理研究所;4 海军青岛特勤疗养中心疗养五区检验科; 5 青岛市疾病预防控制中心/青岛市预防医学研究院)

2型糖尿病(T2DM)是一种慢性代谢紊乱性疾病,我国T2DM病人高达1.14亿,居世界首位[1]。中医临床上常用大柴胡汤治疗T2DM[2-3]。大柴胡汤可以通过调节IRS-1/PI3K/Akt通路活性、糖脂代谢和抑制氧化应激反应来减轻胰岛素抵抗,从而发挥治疗T2DM 的作用[4-6]。本研究采用网络药理学与生物信息学相结合的方法,分析大柴胡汤治疗T2DM的潜在分子生物学机制,探讨大柴胡汤临床治疗T2DM的药效机制,为该方的药理学机制研究提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 大柴胡汤活性成分与作用基因的挖掘

通过在线中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)(https://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)检索大柴胡汤的相关蛋白。以大柴胡汤的药物组成为检索词,将口服生物利用度(OB)≥40%和药物相似性(DL)≥0.20的药物成分相关的蛋白质纳入研究,然后将纳入的蛋白质通过蛋白质数据库(UniProt)(https://www.uniprot.org/)规范为相应的基因。

1.2 T2DM相关基因的筛选

T2DM的相关基因以“‘Type 2 diabetes’and ‘Homo sapiens’ [porgn:_txid9606] and ‘series’ and ‘expression profiling by array’”在PubMed的基因表达数据库(GEO数据库)中检索,共检索到140个可能相关的基因芯片,通过GEO2R对含有T2DM与非T2DM样本的基因芯片进行中位数标准分析,导出T2DM与非T2DM分别处于同一水平的基因样本,将调整后P<0.05且|log10(FC)|>1的基因纳入到本研究。

1.3 大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点基因的筛选

Jvenn在线网站(http://www.bioinformatics.com.cn/static/others/jvenn/index.html)是一个用维恩图比较列表的交互式在线工具。将大柴胡汤的作用靶点基因与T2DM关联的基因均导入Jvenn在线网站,最后获得大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点基因。

1.4 “复方-药材-组分-靶点-疾病”网络构建与分析

采用Cytoscape 3.8.2软件,通过复方、复方药材、部分药材组分、靶点基因以及T2DM构建“复方-药材-组分-靶点-疾病”网络,以明确大柴胡汤治疗T2DM的关键成分、靶点。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

将大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点基因导入到Metascape在线分析软件中(http://metascape.org/)进行GO功能和KEGG通路富集分析。其中GO生物学进程(BP)、KEGG通路、Reactome基因组等数据库是Metascape在线分析软件富集分析的主要来源。Metascape在线分析软件将基因数≥3个、富集因子>1.5且P<0.01的相似GO功能和KEGG通路进行富集分簇分析。富集分析的P值采用累积的超几何分布计算[7];q值采用多次Banjamini-Hochberg过程计算[8];层次聚类分析采用Kappa分数,相似度>0.3的视为同一簇[9]。

1.6 蛋白互作网络分析

采用Metascape在线软件的分子复合物检测法对大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点基因进行模块分析,Metascape在线软件将每个模块的靶点基因分别进行GO功能和KEGG通路分析,并将P值从小到大排列后前3位的GO功能和KEGG通路进行描述。

2 结 果

2.1 大柴胡汤药物活性成分与靶基因筛选

通过TCMSP在线数据库平台获得大柴胡汤的药物活性成分,获得大柴胡汤中OB≥40%和DL≥0.20的药物活性成分98个,其中柴胡12个、黄芩18个、芍药16个、半夏5个、生姜2个、枳实16个、大枣16个、大黄11个,黄芩苷、豆甾醇、槲皮素、圣草酚(黄烷酮)等6个药物活性成分在组方药材2味及以上中药中所含有。利用TCMSP在线软件,获得大柴胡汤的相关靶点蛋白后,通过Uriprot数据库将靶蛋白规范为相应的靶基因名称,剔除重复基因后,最终564个靶基因被纳入到本研究中。

2.2 T2DM相关基因的筛选

GEO数据库中共检索到18套与T2DM相关的基因芯片,18套基因芯片中调整后P<0.05且|log10(FC)|>1的T2DM相关基因共11 641个。

2.3 大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点基因筛选

将大柴胡汤的作用靶点基因与T2DM关联的基因导入到Jvenn在线网站中,得到大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点基因136个,见图1。大柴胡汤复方-药材-组分-靶点-T2DM网络图见图2。表明大柴胡汤的有效药物成分可能通过影响机体的基因而达到治疗疾病的作用。

图1 大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点基因

图2 大柴胡汤复方-药材-组分-靶点-T2DM网络图

2.4 大柴胡汤治疗T2DM相关靶点基因的GO功能和KEGG通路富集分析

采用Metascape在线软件将136个大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点基因进行富集分析,GO功能和KEGG通路富集分析结果显示20个功能簇。大柴胡汤可影响机体对无机物的应答(BP)、脂多糖的应答(BP)、氧化应激反应(BP)、对有机环化合物的细胞反应(BP)、激素刺激的细胞反应(BP)、细胞外刺激的应答(BP)、凋亡信号通路(BP)、活性氧代谢通路(BP)、TNF信号通路(KEGG通路)、细胞死亡的正向调节(BP)、细胞衰老(KEGG通路)、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节(BP)、脂肪酸代谢进程(BP)等BP与信号通路来治疗T2DM。见图3和表1。

表1 大柴胡汤治疗T2DM靶基因的富集分析

图3 大柴胡汤治疗T2DM靶基因的富集分析图

2.5 大柴胡汤治疗T2DM相关靶点基因的蛋白互作网络分析

采用Metascape在线软件将136个大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点进行蛋白互作网络分析,大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点蛋白共有5个Mcode模块,包含5个以上蛋白的模块有4个,见图4和表2。最复杂模块是模块1,包含19个蛋白,其功能主要集中在蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节、PID-ATF2通路等;模块2包含15个蛋白,主要集中在凋亡信号通路、凋亡过程的正调控、程序性细胞死亡的正调节等功能;模块3和模块4分别包含8个蛋白,分别主要集中在胰腺癌、内分泌抵抗与胺受体配体结合、钙信号通路等BP。

表2 大柴胡汤治疗T2DM靶基因的蛋白互作网络分析

图4 大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点蛋白互作网络分析图

2.6 影响Mcode模块的药物

大柴胡汤中作用于模块1的药物有柴胡、黄芩、枳实、大黄、芍药、生姜、大枣等;作用于模块2的药物有柴胡、枳实、大黄、芍药、大枣等;作用于模块3的药物有柴胡、黄芩、枳实、大黄、半夏、生姜、大枣等;作用于模块4的药物有柴胡、大黄、枳实、大枣等;作用于模块5的药物有柴胡、黄芩等。

3 讨 论

T2DM的发生多是由于病人过食肥甘厚味,导致胃热、肝热或者肝胃俱热。大柴胡汤由柴胡、黄芩、大黄、枳实、芍药、半夏、生姜、大枣等组成,主要起到和解少阳、内泻热结的功效,王国斌与仝小林均运用大柴胡汤治疗T2DM[2,10]。本研究结果显示,大柴胡汤中OB≥40%和DL≥0.20的药物活性成分98个,得到大柴胡汤治疗T2DM的相关靶点基因136个。基因/蛋白富集分析结果显示,大柴胡汤治疗T2DM的靶点基因,其BP与信号通路主要集中在对无机物的应答、脂多糖的应答、氧化应激反应、激素刺激的细胞反应、细胞外刺激的应答、凋亡信号通路、活性氧代谢通路、TNF信号通路、细胞死亡的正向调节、细胞衰老、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节、脂肪酸代谢进程、钙信号通路等。说明大柴胡汤可能通过影响氧化应激反应、脂肪酸代谢进程、活性氧代谢通路等BP与信号通路来治疗T2DM。有研究结果表明,大柴胡汤中能提取黄芩苷、芍药苷[11-12],而黄芩苷能够激活胰岛素受体底物-1和葡萄糖转运蛋白-4,并能激活AMPK-PI3K/Akt与MAPK/ERK信号通路,进而有效地刺激机体葡萄糖的吸收[11,13-17],这与本研究结论一致。大柴胡汤提取物治疗四氯化碳中毒导致的急性肝损伤大鼠的研究发现,大柴胡汤能预防超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶等活性氧代谢损伤[18-19],而氧化应激已被认为是T2DM发生发展的关键因素,并最终导致脂质过氧化[20-24],这与本研究中大柴胡汤治疗T2DM相关靶点基因富集于氧化应激反应、活性氧代谢通路等结论一致。动物实验发现,大柴胡汤可以抑制胰腺脂肪酶的活性,进而降低三酰甘油、胆固醇和游离脂肪酸等血脂指标的水平[25-27]。T2DM是一种典型的脂代谢紊乱性疾病,目前研究显示该病和三酰甘油、总胆固醇、游离脂肪酸等脂肪酸代谢密切相关[28-31]。这与本研究中大柴胡汤治疗T2DM相关靶点基因富集于脂肪酸代谢进程等结果一致。

本研究还显示,大柴胡汤治疗T2DM的靶点基因主要集中在对无机物的应答、激素刺激的细胞反应、凋亡信号通路、TNF信号通路、细胞死亡的正向调节、细胞衰老、蛋白质丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调节等BP与信号通路,而T2DM与上述BP和通路均相关,研究大柴胡汤与上述BP和通路的关系是今后大柴胡汤治疗T2DM的研究方向。大柴胡汤不同的药物组成作用在不同的模块上,也为今后探讨临床用药的药理学机制与各种药物组成在临床中发挥协同作用提供新的研究思路,为中西医的融合发展起到促进作用。

综上所述,本研究发现大柴胡汤能够通过影响脂多糖的应答、细胞外刺激、氧化应激反应、活性氧代谢通路、脂肪酸代谢等生物学通路来影响胰岛细胞的分泌和降低血脂指标,达到清泄“肝胃郁热”的作用,从而使T2DM病人的血糖降低。通过动物和(或)细胞实验将网络药理学与生物信息学预测的结果进行验证是我们的下一步研究方向。