饲料添加剂对体外瘤胃发酵和甲烷产生量的交互影响

包乌日汉， 杜 莎， 王鹏宇， 姚军虎， 齐景伟， 徐 明，

（1.内蒙古农业大学动物科学学院，内蒙古呼和浩特 014010；2.内蒙古优然牧业有限责任公司，内蒙古呼和浩特 015200；3.西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100）

反刍动物瘤胃产生的甲烷， 既造成了能量损失， 也是温室气体的主要来源之一 （王小晶，2009）。 据统计，全球反刍动物的甲烷年排放量达8000 万t， 占到全球人类活动释放甲烷量的28%（陈晓维，2009）。 Wu 等（2022）发现，通过调节瘤胃能量供应量、 提供优质粗饲料和降低原虫数量可降低甲烷排放量。根据抑制甲烷机制不同，甲烷抑制剂可以分为三类：氢受体类、微生物调节类和酶抑制剂。 Wu 等（2022）报道，三类甲烷抑制剂之间对体外甲烷产生量之间没有交互影响。 本试验选择典型的氢受体类和微生物调节类代表延胡索酸、 莫能菌素， 兼氢受体类和微生物调节类亚麻油， 进一步研究氢受体类和微生物调节类之间及内部对体外发酵和甲烷生成的交互影响。

1 材料与方法

1.1 试验材料 莫能菌素由山东胜利股份有限公司（山东生济南市）提供，商品名为莫能菌素预混合剂，包含20%莫能菌素，添加到发酵底物中，莫能菌素有效添加量分别为0、120 mg/kg DM。 延胡索酸为纯酸（F8509-100 G），从SIGMA-ALDRICH （St.Louis，MO，USA） 购买， 发酵时直接添加到发酵液中，添加量分别为0、6.9 mmol。 亚麻油从上海麦克林公司（上海）购买，含量＞99%，发酵时直接添加到发酵液中，添加量为0、3.1 mmol。

本研究包括两个体外发酵试验。 试验1 研究莫能菌素和延胡索酸的交互作用，共4 个处理组，每个处理组6 个重复。试验2 研究莫能菌素、延胡索酸和亚麻油的交互影响，共8 个处理组，每个处理组8 个重复。

1.2 瘤胃液 瘤胃液从3 只成年山羊瘤胃获得。供体山羊的饲料总量为2.4 kg DM， 在08：00 和20：00 分为两次饲喂。 饲料中含有50%精料和50%苜蓿干草。 精料中含有70%玉米粉、25%豆粕和5%预混料，预混料中不包含任何甲烷抑制剂。

在晨饲前采集3 只瘤胃瘘管山羊的瘤胃内容物，移到二氧化碳保温盒中，然后立即运送到实验室（在5 min 内）。 将3 只供体山羊的瘤胃内容物混合（1∶1∶1），然后用搅拌机（Fisher14-509-1）在二氧化碳下混合20 s， 将杂质从饲料颗粒中分离出来。 将混合后的样品通过四层纱布和玻璃棉进行过滤，作为瘤胃液进行后续发酵。

1.3 体外发酵 发酵瓶容积为260 mL， 每个瓶内加入600 mg 饲料。 将这些瘤胃缓冲液（1100 mL）和瘤胃液（200 mL）在二氧化碳环境下混合加热，然后把50 mL 加入到发酵容器中， 通入二氧化碳，在39 ℃下发酵24 h。

1.4 样品的采集和分析 发酵24 h 之后， 用冰块冷却发酵瓶，待气体温度接近室内温度时，用玻璃针管连接针头测定气体产生量，取10 mL 气体样品贮存在无抗凝剂的真空采血管中。 将气体样品用采样注射器转移到真空试管中， 然后用气相色谱仪分析甲烷含量。 使用pH 仪对发酵底物进行pH 分析，取1.5 mL 的发酵底物，加入0.3 mL 的偏磷酸溶液（250 g/L），离心15 min（39000 ×g，4 ℃）。取1 mL 的上清液，用气相色谱法分析总挥发性脂肪酸（VFA）组成（乙酸、丁酸、丙酸、戊酸、异丁酸和异戊酸）及含量。

1.5 甲烷产生量的预测 根据Castro 等（2011）推荐公式， 依据发酵液中乙酸、 丙酸和丁酸浓度（mmol/mol VFA），计算甲烷产生量预测值：

甲烷产生量预测值/（mmol/mol VFA） =0.45×乙酸+ 0.4×丁酸-0.275 ×丙酸；

甲烷实际产生量/（mmol/mol VFA）=甲烷产生量（mL）/22.4 /（VFA×50 mL/1000）。

1.6 统计分析 数据采用多因素完全随机试验设计进行分析， 选用SPSS 13.0 的GLM 模型，试验因素包括莫能菌素、 延胡索酸和亚麻油的主效应和两者之间及三者之间的交互作用。 极显著水平为P ≤0.01，显著水平为P ≤0.05，趋于显著为0.05 ＜P ≤0.10。

2 结果

2.1 莫能菌素和延胡索酸的交互影响 由表1可知， 莫能菌素不影响产气量和发酵液pH （P ＞0.05），可显著降低甲烷产量、甲烷在气体中含量及乙酸产量（P ＜0.05），甲烷产量降低了11.1%、甲烷含量降低了11.6%及乙酸产量降低了6.1%；延胡索酸增加了产气量和丙酸比例（P ＜0.05），降低了甲烷产量和含量（P ＜0.05），甲烷产量降低了11.4%，甲烷含量降低了22.0%，不影响发酵pH和VFA 产量（P ＞0.05）。 莫能菌素和延胡索酸对发酵液pH、甲烷产量和含量、产气量及VFA 组成等方面均没有交互影响（P ＞0.05）。

表1 莫能菌素和延胡索酸对日粮体外产气和发酵的影响

2.2 莫能菌素、 延胡索酸和亚麻油的交互影响由表2 可知， 莫能菌素能显著降低产气量和甲烷产量及含量，降低幅度分别为5.7%和15.9%（P ＜0.05），增加发酵液pH（P ＜0.05），降低丁酸和戊酸含量（P ＜0.05）。延胡索酸能降低发酵pH、甲烷产量和含量 （P ＜0.05）， 增加产气量和丙酸比例（P ＜0.05），甲烷产量降低11.0%，趋于降低乙酸比例（P =0.06），显著影响VFA 中的丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸组成及乙丙比（P ＜0.05）。亚麻油能显著降低甲烷产量， 降低幅度为8.1%（P ＜0.05），趋于降低甲烷含量（P = 0.07），显著提高产气量 （P ＜0.05）， 不影响VFA 产量及组成 （P ＞0.05）。 莫能菌素、延胡索酸和亚麻油对发酵pH、甲烷产量和含量、 总产气量及VFA 组成等方面均没有两向（P ＞0.05）和三向（P ＞0.05）的交互影响。

表2 莫能菌素、延胡索酸和亚麻油对饲料体发酵外和甲烷产生的影响

3 讨论

反刍动物甲烷排放不仅造成饲料能量损失，还会导致全球气候变暖。 甲烷是瘤胃碳水化合物发酵过程中不可避免的产物， 通过将甲烷转化为丙酸可降低甲烷的产生（王丽凤，2004）。不同甲烷抑制剂均能显著减少甲烷排放量， 对温室气体减排和提高经济、社会效益都将具有深远意义（陈锐等，2022）。本试验利用体外发酵方法，检测莫能菌素、 延胡索酸和亚麻油对降低体外甲烷产生量的交互作用，为实践应用提供依据。

莫能菌素是典型的微生物调节类的甲烷抑制剂。研究表明，莫能菌素作为饲料添加剂能降低甲烷能量损失、乙丙比例、瘤胃液pH 变异程度（杨华明等，2016）， 主要是莫能菌素可抑制瘤胃内革兰氏阳性菌生长，从而抑制甲烷的产生，改善饲料转化率（朱俊红等，2022；韩金涛，2014）。 Kim 等（2014）研究表明，莫能菌素抑制了纤维分解菌、甲酸脱氢酶活性，同时增强了分解淀粉的能力，减少了生产甲烷所需的氢。 在本研究中莫能菌素降低了甲烷生成和乙丙比例， 这与之前的研究结果一致（Wischer 等，2013；Ponce 等，2012）。

王荣（2019）等选用玉米和菊苣作为体外发酵底物，研究发现，延胡索酸有抑制甲烷生成的作用， 且延胡索酸和底物对氢含量和甲烷产量不存在交互影响，刘南南（2014）也得到同样的结论。 延胡索酸作为丙酸生成的中间体，它的添加可增加瘤胃丙酸产量。 经动物试验验证，添加延胡索酸可使甲烷释放量减少约20%（李琳等，2010；Asanuma 等，1999）。本研究显示，延胡索酸增加了体外发酵产气量和丙酸比例， 降低了甲烷产量， 这与之前的报道一致 （Hook 等，2010；Newbold 等，2005）。

多不饱和脂肪酸可作为氢受体来降低甲烷的生成， 同时可抑制甲烷生成相关菌（原虫和甲烷菌）。 本试验选用的亚麻油，是兼具氢受体和微生物调节功能的甲烷抑制剂。 张春梅（2010）研究显示， 亚麻油可显著提高总挥发性脂肪酸和丙酸含量，降低甲烷产生量。 谭健（2021）研究显示，亚麻油中不饱和脂肪酸会通过生物氢化作用促进氢的利用，进而减少氢浓度，以减少甲烷生成。 本研究结果显示，亚麻油显著降低了甲烷产量，与前人研究结果一致（谭健等，2021；张春梅等，2010）。

尽管甲烷抑制剂在反刍动物饲料中被广泛使用， 但以往的研究较少讨论多种甲烷抑制剂之间的交互影响。一篇早期的研究报道，莫能菌素和延胡索酸联合发酵时， 莫能菌素和延胡索酸对甲烷产量、产气量、VFA 等均没有交互影响（Callaway，1996）。 进一步研究发现，氢分压是瘤胃产生丙酸和甲烷的标志指标， 延胡索酸和莫能菌素在促进瘤胃丙酸生成方面具有较好的协同效应， 具有一定的可加性 （李宗军，2018；Castro-Montoya 等，2012；McGinn 等，2004）。也有研究显示，莫能菌素和延胡索酸对体外甲烷产生量之间没有交互影响（Wu 等，2022）。 本研究中观察到，跟单独使用莫能菌素或延胡索酸相比， 同时添加莫能菌素和延胡索酸对甲烷的抑制作用更大， 这两种添加剂通过两种机制相互独立地降低甲烷产生， 这与前人研究报道一致。 Wu 等（2022）报道，三种甲烷抑制剂莫能菌素、 延胡索酸和溴化甲烷对体外甲烷产生量之间没有交互影响。本研究结果显示，三种甲烷抑制剂莫能菌素、 延胡索酸和亚麻油之间对体外甲烷抑制也不存在交互影响， 与Wu 等（2022）报道一致。

根据这两个试验结果，基于乙酸、丁酸和丙酸产量对甲烷产量进行预测 （Castillo 等，2011），再将预测产量和实际甲烷产量之间进行回归分析，见图1。 结果显示，实测甲烷产量与预测甲烷产量之间存在显著相关性。表明延胡索酸、莫能菌素和亚麻油这三种甲烷抑制剂对甲烷生成的抑制作用均是通过改变乙酸、丙酸和丁酸比例来实现的。莫能菌素通过抑制革兰氏阳性细菌和原生动物降低乙酸并增加丙酸产量 （Kumar 等，2013；Ellis 等，2012；Hook 等，2010）； 延胡索酸与产甲烷菌竞争利用代谢氢， 从而直接降低乙酸产量并增加丙酸产量 （Hook 等，2010；Li 等，2009；Castillo 等，2004）。本文在Wu 等（2022）的试验基础上增加了亚麻籽油，其主要含有十八碳不饱和脂肪酸，不饱和脂肪酸可以作为电子受体与甲烷菌竞争氢，通过加氢的顺-反异构化反应生成饱和脂肪酸，从而减少甲烷生成（王泽富等，2022；Dewanckele 等，2020）。 但溴化甲烷并不是通过改变VFA 谱的机制来实现的（Wu 等，2022）。 综合上述结果，氢受体类和微生物调节类甲烷抑制剂均是最终通过改变VFA 谱的机制来降低甲烷的，而酶抑制剂类甲烷抑制剂直接抑制甲烷生成酶，不通过VFA 谱这条途径。

图1 甲烷产量预测值和实测值之间的线性回归

4 结论

综合两个试验，延胡索酸、莫能菌素或亚麻油均可有效降低体外甲烷产生量，且三种添加剂没有两向和三向交互作用。这三种甲烷抑制剂对甲烷生成的抑制作用在一定范围内具有可加性。