茶园间作绿肥对土壤微生物群落代谢功能差异的影响

王 华，傅海平*，周品谦，莫泽东，王沅江*

1.湖南省农业科学院 茶叶研究所，湖南 长沙 410125；2.安化县土壤肥料工作站，湖南 安化 413500

土壤微生物是土壤物质转化、养分循环和能量流动的重要驱动因子[1]，是“植物-土壤微生物-土壤养分”系统的联系纽带[2]，是衡量土壤质量的关键指标[3]，因此微生物多样性对土壤生态系统的稳定具有重要意义。大量研究表明，不同种植模式和作物均会不同程度地影响土壤微生物群落[4]，合适的农艺措施对土壤微生物群落结构和功能多样性的调控起积极作用[5]。间作是茶园特别是幼龄茶园的一种栽培模式，其利用生态位的分离将光、热、水、养分等资源实现最大化利用。目前，关于茶园间作模式的研究主要集中在茶树生长[6]、茶园生态环境[7]、土壤养分[8]、土壤酶活性[9]等方面，对间作模式茶园土壤微生物群落的研究相对较少。研究发现，间作生态系统中的作物对土壤中微生物的多样性产生影响，而土壤中的微生物群落结构和功能对系统养分的利用产生影响[10]。

目前，研究土壤微生物群落结构多采用高通量测序（High-throughput sequencing）、末端限制性内切酶片段长度多态性（T-RFLP）、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、磷脂脂肪酸法（PLFA）等分子生物学方法，其能够体现微生物群落结构信息，但不能获取微生物代谢功能。Biolog-ECO技术是解析微生物对不同种类碳源利用多样性及评价微生物群落功能多样性与代谢活性的方法[11]，在土壤微生物多样性研究中广泛应用[12-13]。而在茶园间作绿肥对土壤微生物代谢功能的影响方面，鲜见研究报道。本试验以间作绿肥茶园为研究对象，采用Biolog-ECO技术探讨土壤微生物群落代谢功能的差异性，旨在揭示间作绿肥茶园土壤微生物群落特征，探明绿肥对茶园土壤微生物群落的影响，为绿肥在茶园的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计

试验设在湖南省茶叶研究所长沙县高桥镇试验基地（N 28°28′40.9′′、E 113°20′23.8′′）。茶树品种为‘黄金茶2号’，种植规格双行双株（行距160 cm），种植时间2017年。土壤类型为黄壤，土壤肥力（0～20 cm）：pH 4.84，有机质含量为19.0 g/kg，全氮含量为1.27 g/kg，碱解氮含量为89.0 mg/kg，有效磷含量为4.07 mg/kg，速效钾含量为143.0 mg/kg。

试验设2个处理：间作绿肥（GM）与未间作绿肥（CK）。间作绿肥处理：每年10—11月种植毛叶苕子，4月种植田菁，每个处理均3次重复，每个小区面积50 m2。分别采用刈割开沟翻压还田的方式。其他田间管理措施一致。

1.2 土壤样品采集

采用S形布点法。选5个点，用土钻取0～20 cm土层土样，剔除石块、植物残根等杂物后将土壤样品混匀后分成2份，一份4℃保存，用于Biolog碳源利用、硝态氮和铵态氮的测定；另一份风干，用于土壤理化性质分析。

1.3 试验方法

1.3.1 土壤理化性状测定

pH值、有机质、全氮、碱解氮、有效磷、速效钾等分别采用电位法（水浸）、电热板加热-重铬酸钾容量法、凯氏蒸馏法、碱解扩散法、NH4F-HCl浸提-钼锑抗比色法、NH4OAc浸提-火焰光度法测定[16]。硝态氮与铵态氮的测定采用LY/T 1228—2015方法进行。

1.3.2 Biolog-ECO检测

称取10.0 g新鲜土样置于装有90 mL已灭菌生理盐水（0.85%NaCl）的三角瓶内，在转速200 r/min下振荡30 min，静置10 min后用生理盐水（0.85%NaCl）稀释到10-3，将稀释好的土壤悬浊液150 μL接种到Biolog-Eco板（BIOLOG，Hayward，USA）的每个微孔中，接种后的ECO板在25℃下培养。每隔24 h用Biolog Reader仪（BIOLOG，Hayward，USA）测定波长590 nm和750 nm的吸光值。

1.4 数据分析

土壤微生物碳源利用率平均吸光值：AWCD =∑(Ci-R)/n。

Shannon多样性指数（H）：H= -∑PilnPi。

碳源利用丰富度指数（S）= 被利用碳源的总数。碳源利用丰富度指数即颜色变化的孔数，吸光值小于0.25视为颜色没有变化。

Pielou均匀度指数（E）：E=H/lnS。

Simpson优势度指数（D）：D=1-∑P2i。

McIntosh指数（U）：

丰富度指数S＝被利用碳源的总数目（C-R＞0.2的孔数）。

其中：Ci为第i孔的相对吸光值；R为对照孔的吸光值；n为碳源种类数；S为被利用的碳源总数；Pi为第i孔与对照孔的相对吸光值差与整个平板相对吸光值总和的比值。

采用SPSS 22.0进行方差（LSD检验法）和主成分分析，Microsoft Excel 2010进行数据统计，采用Origin 8.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 间作绿肥处理土壤微生物对碳源的利用

由图1可知，土壤微生物群落随培养时间的推移AWSD呈上升趋势，其中48 h内其值均较低，碳源的利用较弱，处理间没有差异。48～120 h，不同处理AWSD值均呈快速增长，且间作绿肥处理增长速度高于对照。120～240 h，AWSD值增长速度趋缓，但间作绿肥处理AWSD仍高于对照。AWSD的总体变化为间作绿肥处理比对照大，表明间作绿肥处理土壤微生物群落代谢快，提高了土壤微生物群落对碳源的利用能力，活性最强。

图1 茶园土壤微生物平均颜色变化率随培养时间的变化Figure 1 Changes in the average color change rate of soil microorganisms in tea garden with cultivation time

2.2 土壤微生物群落利用不同碳源的特征

31种碳源根据碳源底物的官能团、微生物的代谢途径以及生态功能分为6类，分别为糖类、氨基酸、胺类、酚酸类、聚合物和羧酸类。由图2可知，土壤微生物对6类碳源的利用率随培养时间的推移而增加，表明茶园间作绿肥提高了土壤微生物群落对碳源的利用率。

图2 茶园土壤微生物不同碳源利用强度Figure 2 Different carbon source utilization intensities of tea garden soil microorganisms

试验结果还表明，不同处理土壤微生物利用6类碳源的能力上具有差异。对照土壤微生物对不同碳源的利用水平由高到低依次为羧酸类、氨基酸类、聚合物、糖类、酚酸类和胺类，而间作绿肥处理对不同类碳源的利用水平中酚酸类高于糖类，其他与对照无差异。间作绿肥处理对聚合物的利用强度显著高于对照（p＜0.05）,同时提高了羧酸类、氨基酸类、酚酸类、糖类和胺类的利用强度，但差异不显著（p＞ 0.05）（图3）。

图3 培养168 h微生物对碳源的利用强度（AWSD）Figure 3 Utilization intensity of carbon sources by microorganisms cultured for 168 h

图 4 茶园间作绿肥对土壤微生物群落碳源利用主成分分析Figure 4 Principal component analysis of carbon source utilization by soil microbial communities under intercropping green manure in tea gardens

2.3 土壤微生物群落功能的多样性

间作绿肥处理茶园土壤微生物Shannon指数和均匀度指数稍低于对照，但是两者间差异不显著（表1）。

表1 间作绿肥处理茶园土壤微生物群落多样性指数Table 1 Diversity indexes of soil microbial communities in tea gardens treated with intercropping green manure

2.4 土壤微生物群落功能多样性主成分分析

以培养168 h处理测定数据进行主成分分析，提取了3个主成分，第一主成分（PC1）为48.08%，第二主成分（PC2）为19.08%，第三主成分（PC3）为15.72%，3个主成分累计贡献率为82.88%，可解释变量的大部分信息（表2）。

表2 方差分解的主成分提取分析Table 2 Analysis of principal component extraction of variance decomposition

选前两个主成分PC1和PC2来表征间作绿肥处理对土壤微生物碳源代谢影响（图4）。GM处理主要分布PC1正端，CK则分布在负端，PC1可以区分不同处理茶园土壤微生物群落碳源代谢差异。

载荷值越大，表明该碳源对主成分的影响越大。由表3可知，除β-甲基-D-葡萄糖苷和1-磷酸葡萄糖外，其他29种碳源与PC1、PC2或PC3有高的相关性（载荷绝对值 ＞ 0.6）。PC1中影响较大的碳源有20种，主要包括7种糖类（D-半乳糖酸-γ-内酯、I-赤藓糖醇、D-甘露醇、N-乙酰基-D-葡萄糖胺、D-纤维二糖、α-D-乳糖、D,L- α-磷酸甘油）、3种氨基酸（L-天门冬酰胺、L-苯基丙氨酸和L-苏氨酸）、1种胺类（苯乙胺）、2种酚酸类（2-羟基苯甲酸和4-羟基苯甲酸）、2种聚合物（吐温40、吐温80）和5种羧酸类（丙酮酸甲脂、D-半乳糖醛酸、γ-羟基丁酸、D-葡萄糖胺酸和衣康酸），其中L-苏氨酸的贡献值最大。PC2中影响较大的碳源有5种，分别为糖类1种（D -木糖）、氨基酸1种（L-丝氨酸）、聚合物2种（α-环式糊精和肝糖）与羧酸类1种（D-苹果酸），其中L-丝氨酸的贡献值最大。PC3中影响较大的碳源有5种，包括糖类1种（I-赤藓糖醇）、氨基酸2种（L-精氨酸和甘氨酰-L-谷氨酸）、胺类1种（腐胺）及羧酸类1种（α-丁酮酸），其中α-丁酮酸的贡献值最大。

表3 31种碳源的主成分载荷因子Table 3 Principal component load factors of 31 carbon sources

2.5 土壤微生物与土壤理化性状的关系

由表4可知，糖类与土壤有机质、全氮显著正相关（p＜ 0.05），胺类与有机质显著正相关（p＜ 0.05），聚合物与土壤全氮极显著正相关（p＜ 0.01）、铵态氮和硝态氮显著正相关（p＜ 0.05），羧酸类与有机质、硝态氮显著正相关（p＜ 0.05），酚酸类与有机质和硝态氮显著正相关（p＜ 0.05），6类碳源与碱解氮、速效磷和速效钾的相关性均不显著（p＞ 0.05）。

表4 6类碳源与土壤理化性质相关性分析Table 4 Correlation analysis between 6 types of carbon sources and soil physicochemical properties

3 结论

以新建茶园土壤为试验对象，采用Biolog-ECO微平板法探讨了茶园间作绿肥土壤微生物功能多样性的变化。得到如下结论：（1）AWCD值变化表现为间作绿肥处理比未间作绿肥处理变化大；（2）茶园土壤微生物对羧酸类、氨基酸类和聚合物类的利用高于其他类碳源的利用，间作绿肥处理对碳源的利用强度均高于对照（未间作绿肥处理），两者在聚合物的利用强度差异达显著（p＜ 0.05）,同时间作绿肥处理对酚酸类化合物的利用强度高于糖类，而对照糖类的利用强度高于酚酸类。