白参菌茶降脂活性评价及活性成分来源的初步研究

潘联云，赵 碧，杨方慧，马玉青，刘本英

云南省农业科学院 茶叶研究所/云南省茶学重点实验室，云南 勐海 666200

现有研究表明，茶叶及茶叶中的生物活性成分具有多种保健功效，如降血脂、降血糖、抗氧化、保肝护肝等[1]。茶叶接种有益微生物可提升茶叶品质及功效，如接种冠突散囊菌可提升茶叶中多糖含量，增强抗氧化活性[2]。白参菌（SchizophyllumcommuneFr.）是一种食药兼用名贵珍稀菇菌，别名裂褶菌、白蕈、树花、鸡毛菌[3]。隶属真菌门（Eumycophyta）担子菌纲（Basidiomyeetes）伞菌目（Agarieales）裂褶菌科（Sehizophyllaceae）裂褶菌属（Schizophyllum）[4]。白参菌具有清肝明目、滋补强身的功效，可治疗小儿盗汗、妇科疾病、神经衰弱及头昏耳鸣等症状，多糖是其主要活性功能成分。云南省农业科学院茶叶研究所利用普洱茶渥堆发酵工艺，以改善中低档茶叶品质为目的，针对白参菌与茶共生的特点，用秋季修剪的嫩梢及半成熟叶制作晒青干毛茶，开发具有茶和菌双重特色的茶制品——白参菌茶[5,6]。

粗老的晒青茶原料经白参菌发酵后品质特征得到显著改善：汤色由黄绿转变为橙红，滋味变醇，口感协调[6]。生化成分检测分析发现，经过与白参菌发酵后茶叶中表没食子儿茶素、表儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯的含量均大幅下降，降低比例高达80%以上，从而减少茶汤苦涩，提高口感[7]。通过以茶叶为培养基种植白参菌发现，与普通人工种植和野生生长的白参菌相比，粗老晒青毛茶作为基质培养的白参菌氨基酸、多糖以及锌、钾、磷含量显著增加[8]。可见，白参菌不仅可改善粗老毛茶的感官品质，也可提高茶叶的保健功效。本研究使用模式生物秀丽隐杆线虫，考察白参菌茶降脂减肥和抗衰老等方面的保健功效，并对其功效活性物质来源进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验材料

晒青毛茶和白参菌茶（云南省农业科学院茶叶研究所制备）；白参菌（云南省农业科学院茶叶研究所筛选，在实验室–20℃条件下保存）；线虫品系N2和大肠杆菌E.coliOP50（Caenorhabditis Genetics Center，CGC）。

1.1.2 仪器与试剂

主要仪器：正置荧光显微镜，奥林巴斯公司；SMZ168型体视显微镜，麦克奥迪医疗诊断系统有限公司；leica/MI65C体视显微镜，德国leica公司；SW-CJ-1FD型双人单面净化工作台，苏州净化设备有限公司；LRH-500F型恒温恒湿培养箱，上海一恒科技有限公司；超纯水器，Barnstead公司；ZHWY-211C型摇床，上海智城分析仪器制造有限公司。

主要试剂：油红O、Triton X-100、甘油，Sigma公司；胆固醇，Genview公司；无水乙醇、异丙醇、磷酸二氢钾、三水合磷酸氢二钾、十二水合磷酸氢二钠、氯化钙、硫酸镁、氢氧化钠、葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；LP2001酵母粉、P0137蛋白胨，OXID公司；琼脂、PBS磷酸盐缓冲剂（pH 7.4），鼎国昌盛生物技术有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 秀丽隐杆线虫及其食物E.coliOP50的培养

线虫培养条件：温度20℃±0.5℃，湿度40%～60%，食物为灭活E.coliOP50。秀丽隐杆线虫及其食物E.coliOP50培养方法参照文献[9]进行。本试验中线虫干预时间为幼虫期到成虫期（产卵期）。

1.2.2 秀丽隐杆线虫同步化

采用次氯酸钠法，方法参考Eirini Lionaki和Nektarios Tavernarakis进行[10]。

1.2.3 秀丽隐杆线虫脂质测定

采用油红O（Oil Red O, ORO）染色法，按前人报告[11]，用PBST（1×PBS和0.01% Triton X-100混合液）洗下待染色秀丽隐杆线虫，悬浮沉淀2次，吸去上清留沉淀的线虫；在沉淀中加入500 μL 40%异丙醇和100 μL油红O染色液，室温摇动染色30 min；离心去上清液，PBST清洗3次去浮色；将染色后的秀丽隐杆线虫置于载玻片上，使用显微镜拍照；每个实验组3次以上生物学重复，每次重复线虫大于8条。使用Image pro plus（IPP）测量染色后秀丽隐杆线虫脂质的积分光密度和虫体总面积（Area），以平均光密度表示线虫脂肪含量：MOD = IOD/Area。

1.2.4 秀丽隐杆线虫寿命试验

用不同浓度水提物（50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L和500 mg/L）作为处理组对同步化N2线虫干预至成虫期，对照组不做任何处理。每天记录线虫的死亡数目。死亡判断标准为：用Picker轻轻接触线虫的虫体无反应。对于在转移过程中丢失的线虫和因爬到培养皿壁而死亡的线虫作事故丢失处理，在统计处理中作为“Censored”。

1.2.5 白参菌培养和菌落测量

将白参菌菌株接种于PDA培养基上培养6 d进行活化，使用打孔器取5 mm活化后的白参菌，菌饼分别转接到正常PDA平板和含有茶水添加的PDA平板上，在恒温恒湿培养箱中连续培养6 d，培养温度均为28℃，避光培养。

1.3 数据分析

利用统计软件SPSS 18.0比较试验数据差异性，使用单变量-单因素方差分析显著性。若方差齐性相等（Sig＞ 0.05），使用LSD法分析显著性；若方差齐性不相等（Sig＜ 0.05），使用Tamhane法分析显著性。使用软件Origin 9.0作图。数据用平均值±标准误差（x-±SEM）表示。“*”表示p＜ 0.05，“**”表示p＜ 0.01，“***”表示p＜ 0.001。

2 结果与分析

2.1 白参菌茶对秀丽隐杆线虫脂质和寿命的影响

与对照组相比，在正常饮食条件下，50 mg/L和100 mg/L白参菌茶水提物处理降低线虫脂质含量的作用不显著，200 mg/L、500 mg/L和1000 mg/L处理分别降低线虫脂质18.6%（p＜0.01）、23.6%（p＜ 0.01）和33.2%（p＜ 0.01）（图1-A和图1-B）。在实验浓度范围内，白参菌茶的降脂作用呈浓度依赖性，与给茶浓度成正比。

图1 白参菌茶的生物活性Figure 1 The biological activity of Schizophyllum fermented tea

在高糖饮食条件下，高糖饮食显著增加秀丽隐杆线虫脂质含量75.8%，白参菌茶干预组分别降低高糖饮食线虫脂质28.7%（50 mg/L）（p＜0.01）、43.9%（100 mg/L）（p＜ 0.01）、60.9%（200 mg/L）（p＜ 0.01）、56.2%（500 mg/L）（p＜ 0.01）和42.4%（1000 mg/L）（p＜ 0.01），实验中所有浓度的白参菌茶水提物对高糖饮食线虫均呈现显著降脂效果（图1-A和图1-B）。通过寿命实验研究发现，与对照组相比，所有实验浓度的白参菌茶均不影响秀丽隐杆线虫的平均健康寿命（图1-C）。

2.2 白参菌茶降脂活性来源

由于白参菌发酵茶兼具白参菌和茶叶的双重特色，其功能活性物质来源也可能兼有菌成分和茶成分。研究使用勐海大叶茶晒青茶、白参菌茶和发酵白参菌茶的粗老原料分别饲喂秀丽隐杆线虫，发现晒青茶和白参菌茶均显著降低秀丽隐杆线虫脂质，粗老原料对秀丽隐杆线虫脂质无显著降低作用（图2-A和B）。寿命实验也表明，晒青茶和粗老原料对线虫平均健康寿命无影响（图2-C和D）。这说明白参菌发酵茶叶能够提高其降脂活性，但不影响茶叶延长线虫寿命的作用。

图2 勐海大叶茶、粗老原料茶和白参菌茶的降脂活性比较Figure 2 Comparison of the lipid-lowering effect of Menghai large leaf sun-dried green tea, rough raw and Schizophyllum fermented tea

由于毛茶原料在发酵过程中各种内含成分均下降[4,5]，推测白参菌茶的活性成分可能主要来自菌的成分。使用白参菌茶和茶为基质培养的白参菌分别饲喂秀丽隐杆线虫发现，在正常饮食和高糖饮食条件下白参菌都具有和白参菌茶基本相同的降脂活性（图3），表明白参菌茶的降脂活性主要来自白参菌。

图3 白参菌茶和白参菌的降脂活性比较Figure 3 Comparison of the lipid-lowering effect of Schizophyllum fermented tea and Schizophyllum

2.3 茶叶水提物抑制白参菌生长且诱导菌丝分泌物情况

为进一步研究白参菌茶发酵过程中菌的变化，本试验将5 mm活化后的白参菌菌饼分别接种于正常PDA平板（对照组）和含粗老晒青茶水提物（100 g/L）PDA平板（干预组）上，连续培养5 d。结果发现，在培养到第4天时，干预组的白参菌菌落面积与茶叶水提物浓度呈现负相关，白参菌菌落生长随着茶叶水提物浓度增加而显著被抑制（图4-A和图1-B）。将对照组菌落生长速率设为1，与对照组相比，干预组的白参菌菌落生长速率显著降低，生长速率与茶叶浓度负相关（图4-C）。通过接种白参菌也发现，茶叶培养基种植的白参菌子实体显著小于野生白参菌和人工接种的白参菌（图4-D）。上述结果表明，茶叶水提物能够显著抑制白参菌菌落的生长。

图4 茶叶对白参菌生长的影响Figure 4 The effect of tea on the growth of Schizophyllum

进一步使用显微镜观察茶叶水提物对白参菌菌丝形态变化的影响，结果发现，与对照组相比，茶叶水提物干预组的白参菌菌丝产生大量分泌物，随着茶叶水提物浓度的增加，白参菌菌丝分泌物的数量呈现先增后减（图5-A和图5-C）。该分泌物呈现水滴样，悬挂于菌丝之间，其体积与培养时间呈正相关，且通过机械力作用（敲打和反复摇晃培养皿）不能使该分泌物掉落（图5-B和图5-D）。根据上述结果，我们认为白参菌菌丝产生的分泌物可能是茶叶水提物抑制其生长所分泌的次生代谢物，这些代谢物可能与白参菌茶活性相关。

图5 茶叶诱导白参菌菌丝产生分泌物Figure 5 Tea induce the production of secreta from mycelia of Schizophyllum

3 讨论

云南是中国四大茶产区之一，茶产业是云南省传统优势产业和高原特色农业的重要组成部分[12]。但云南省茶叶存在精深加工类产品开发不够、茶叶出口产品始终处于茶叶产业链中下游等问题，加之夏秋茶质量较差、效益低、利用率不高[13]，开发茶叶深加工产品及提高夏秋茶利用率是云南省茶产业的未来发展方向。研究表明，茶叶通过白参菌发酵能够提高其品质、活性成分和保健功能。可见，利用白参菌发酵茶叶是一种提高夏秋茶利用率的新的途径和方法。

本试验研究以秀丽隐杆线虫为模式生物评价白参菌茶功能活性，发现发酵白参菌茶的粗老原料对秀丽隐杆线虫没有降脂作用，而白参菌茶的降脂活性与勐海大叶种晒青茶相当，说明白参菌发酵茶叶能够增加其降脂活性。白参菌茶、粗老原料和勐海大叶种晒青茶都不影响秀丽隐杆线虫寿命，表明白参菌茶原料及产品安全无毒。

使用茶叶栽培的白参菌和白参菌茶饲喂秀丽隐杆线虫，发现白参菌的降脂效果和白参菌茶一致。结合我们之前的研究结果，茶叶栽培的白参菌子实体多糖含量显著高于野生白参菌和人工普通种植的白参菌，而多糖本身具有降脂活性[14]，进一步说明白参菌茶的降脂活性极大程度可能来源于白参菌。但由于白参菌成品茶中菌的含量并不占多数，且菌和茶无法彻底分离，因此我们无法确认白参菌发酵后的茶叶（纯茶部分）是否具有功能活性，这有待进一步研究。

通过对菌落大小和菌丝观察发现，茶叶能够抑制白参菌生长且诱导白参菌菌丝产生水滴样分泌物。推测这些分泌物可能是菌丝响应茶叶成分的诱导而自分泌产生分泌物，或者是茶叶成分作为菌丝某些代谢产物的前体，通过微生物作用转化并在菌丝上形成。由于分泌物较小，无法直接收集，因此关于分泌物的具体成分有待进一步研究。

综上，白参菌茶具有一定的降脂活性，其活性来源可能主要来自白参菌。