苯二氮卓类策划药氯硝唑仑的研究进展

蒋金芳,杜宇,刘琪,陈绍璞,王志浩

(中国刑事警察学院 法医病理教研室,辽宁 沈阳 110854)

苯二氮卓类药物(Benzodiazepines,BZDs)具有抗焦虑、肌松、催眠、抗惊厥和镇静作用,其大量衍生物及其不同的药理作用导致此类化合物被广泛应用。患者为了取得治疗效果而延长使用时间,往往会导致苯二氮卓类药物的滥用。近年来,一类被称为苯二氮卓类策划药(Designer Benzodiazepines,DBZDs)的新型精神类活性药(New Psychoactive Substances,NPS)因其可获得性在非法药物市场中受到关注。DBZDs中最活跃的化合物之一便是阿普唑仑(Alprazolam)的衍生物氯硝唑仑(Clonazolam)[1]。2015年,在瑞典查获毒品中,欧盟毒品预警系统检索到关于氯硝唑仑的信息。此后在全球非法药物缉获中陆续发现氯硝唑仑,并且毒物信息中心关于氯硝唑仑相关的查询也有所增加[2]。本文对氯硝唑仑的应用、检测以及鉴别检验等进行系统综述,以期为氯硝唑仑的相关研究提供参考。

1 氯硝唑仑概述

氯硝唑仑(Clonazolam,CAS-33887-02-4)于1971年首次合成,属于苯二氮卓类化合物中最活跃的化合物之一[3]。氯硝唑仑化学式为C17H12CIN5O2,是注册药物氯硝西潘的三唑类似物,其核心苯二氮卓骨架中含有氯、硝化和甲基化的三唑取代基,摩尔质量为353.9 g/mol[4];沸点为(576.0±60.0) ℃;在水中的溶解度为0.042 6 mg/mL。

氯硝唑仑具有催眠、抗焦虑、镇静、肌肉松弛和抗惊厥作用,可被用作全身性癫痫的初期治疗药物[5]。氯硝唑仑在20～44岁的年轻人中滥用现象很普遍,以30～34岁的男性为主[6]。氯硝唑仑常存在于片剂、胶囊、丸剂、溶液中,使用剂量为0.5～4 mg[7]。

氯硝唑仑与大脑中的γ-氨基丁酸A受体(GABA-A)结合。γ-氨基丁酸(GABA)是一种活跃于中枢神经系统的抑制性神经递质。在三种GABA受体亚型A、B、C中,GABA-A是苯二氮卓类药物作用的受体[8]。当氯硝唑仑与GABA-A受体结合时,氯离子通道的构象发生变化,氯离子通道频繁开放,导致氯离子的电导性增强,在突触后间隙中高浓度的氯离子降低了膜电位,进而降低了神经元放电,导致中枢神经系统抑制,主要涉及的神经区域包括杏仁核和网状激活系统[9-12]。GABA-A受体可按其α亚基类型细分为α1、α2、α3和α5。GABA-A-α1受体负责镇静,GABA-A-α2受体引起肌肉松弛[13]。从生理学角度来看意味着机体出现镇静和放松。

氯硝唑仑具有很强的药效,服用氯硝唑仑后能引起愉快的印象并消除恐惧,低剂量服用可引起明显的镇静和失忆。服药后30～40 min内效果缓慢增加,产生轻微放松感、镇静感和所谓的“悬浮感”,大约1～1.5 h后达到效果高峰[14]。

氯硝唑仑的药代动学仍处于研究阶段。相关研究认为,一般情况下氯硝唑仑的半衰期为3.6 h[15]。由于在组织中快速再分布,氯硝唑仑主要通过肝脏系统代谢,因此在老年人和肝损伤患者中半衰期较长[5]。大多数苯二氮卓类药物体内作用时间主要取决于其活性代谢物的代谢速率,氯硝唑仑作用持续时间为6～10 h[16]。氯硝唑仑呈中等脂溶性,可被酶分解成代谢物,包括还原(8-氨基氯硝唑仑)、乙酰化(8-乙酰氨基氯硝唑仑)、羟基化(羟基氯硝唑仑)和葡萄糖醛酸化[17]。本体和代谢物均经肾脏通过尿液排出。

苯二氮卓类策划药中许多是制药行业几十年前开发但从未上市,而其他多是在秘密实验室合成后出现在非法药物市场或在互联网上非法销售,未被任何国家批准用于医疗用途[7]。目前,氯硝唑仑在英国属C类药物,持有、生产或供应都是非法行为[5];美国食品药品监督管理局(FDA)尚未批准氯硝唑仑用于治疗[1]。

2 氯硝唑仑的检测

苯二氮卓类策划药是药物辅助性侵犯(Drug-facilitated Sexual Assault,DFSA)案件的常用药物,在低剂量下具有高效活性,快速分布,并且可以容易地口服给药。此外,DFSA犯罪的典型特征是受害者延迟报案或选择沉默,原因或是由于药物产生健忘特性,或是受害者恐惧、羞耻的心理特点[18]。因此对药物检测带来了额外的挑战。氯硝唑仑半衰期仅为3.6 h,代谢和排泄迅速。体液内低浓度含量和短时间范围需要采用高灵敏度的分析方法来检测本体及其代谢物。

氯硝唑仑的检测可以提取现场发现的可疑药剂、粉末、受害者饮用过的剩余液体等,还需提取服用者血液、尿液、毛发、指甲等常规检材[19]。其中尿液和血液在临床检测中最常用,其他组织检材则作为备选。

为获得最佳检测结果,在检测前通常需要对样品进行前处理。由于许多苯二氮卓类策划药及其相应的I期代谢物在其II期代谢过程中与葡萄糖醛酸结合,因此通常在样品制备前进行结合步骤,以增强对非结合分析物的检测并提高整体灵敏度[20]。

样品处理方法取决于分析物的理化性质以及特定分析所需的灵敏度和特异性水平[21]。可以使用蛋白质沉淀法、液-液提取法(LLE)、盐析辅助液-液提取法(SALLE)、固相提取(SPE)或微波辅助提取(MAE)等方法提取血样[22-23]。尿液样本的提取可通过固相萃取或液-液提取(LLE)[21]。与血液和尿液基质相比,毛发在提取目标分析物之前需要多步预处理程序。碎片化的毛发可提高回收率,毛发分割粉碎后还需要去污处理,随后将粉碎或分段的头发在不同溶剂下混合孵化24 h左右[24]。

精神活性类药物的检测和鉴定方法通常由两个分析步骤组成,即初筛实验和确证实验[21-25]。使用初步筛选方法来筛选阳性样本,从而进行后续确证检测。

红外光谱可对疑似氯硝唑仑的化合物进行检验。何思阳等[26]研究发现,在选定测试条件下,氯硝唑仑在1 700～500 cm-1中红外区域内有明显特征峰,1 512和1 351 cm-1处出现芳香族NO2的反称和对称吸收峰。

基于免疫学的NPS筛选检测原理是利用抗原抗体特异性结合来确定氯硝唑仑或排除其他NPS。免疫学检测在识别苯二氮卓类策划药中具有成功进展,包括酶增强免疫法(EMIT)、酶联免疫吸附法(ELISA)、同质酶免疫分析(HEIA)、动态微粒免疫测定(KMI)和克隆酶供体免疫测定(CEDIA)。由于其高效便捷,根据苯二氮卓类策划药在结构上与母体化合物类似这一特点,使用特异性结合抗体可提高检测灵敏度。Bergstrand等[27]研究发现,在4种常见的免疫分析方法(CEDIA、HEIA、EIT II Plus和KIMS II)中对含有氯硝唑仑的尿液进行检测,氯硝唑仑在每种免疫分析中的交叉反应分别为118%,261%,49%和99%。免疫学检测法便捷快速,适用于现场快速检测或初筛检测,但需要实验室同步开发与新结构特异性结合的抗体,由于开发时间和成本原因,免疫学检测法无法全面推广应用。

色谱法通常用于免疫分析法初步筛选后的确证检测,目前是实验室的常规检测技术。研究显示,液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)是进行验证性检测的常用方法[28]。大多数应用报告使用液相色谱-质谱联用技术,不需要在气相色谱-质谱分析前进行繁琐耗时的样品制备。当常规临床毒物检测到免疫分析阳性结果并通过液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)或类似技术进行确认检测时观察到阴性结果,应考虑可能为苯二氮卓类策划药。通过LC-MS/MS分析鉴定血液、尿液中的氯硝唑仑。氯硝唑仑在母体化合物在尿液中的浓度较低(7～23 ng/mL)[29]。由于氯硝唑仑浓度极低并且半衰期只有3.6 h,若无法在摄入后3 h内进行毒理学试验,则需要对氯硝唑仑的活性代谢物进行检测。

Meyer等[30]通过纳米液相色谱高分辨质谱(HRMS)鉴定尿液中氯硝唑仑及主要代谢物发现,8-氨基氯硝唑仑活性最高。因此,对氯硝唑仑筛查方法可集中于主要代谢物。

Kong等[4]利用液相色谱-四极杆/静电场轨道质谱(LC-Q-Orbitrap MS)来分析氯硝唑仑在人肝微粒体和斑马鱼模型的主要代谢产物及代谢途径。该研究基于LC-Q-Orbitrap MS分析结果,在人肝微粒体和斑马鱼中均检测到M1结构,通过碎片离子结构证明M1为氯硝唑仑硝基还原生成的代谢物并建议将其硝基还原产物M1结构作为检测标志物。此外,该研究采用的斑马鱼模型能良好地模拟人体代谢,对未来苯二氮卓类策划药代谢产物筛选的实验研究提供了参考。

3 氯硝唑仑滥用的危害

作为近年来新发现的精神类活性药,氯硝唑仑在低剂量下表现出极高的活性,常规剂量服用有镇静和记忆消除的作用,在急性中毒时表现为长时间昏迷、肌张力降低等。氯硝唑仑与酒精或其他中枢神经系统抑制剂联用或引起更为严重的中毒后果。

氯硝唑仑过量服用致急性中毒表现为深度昏迷和轻度窦性心动过速[31-32],多数患者可在24 h内恢复。关于氯硝唑仑过量服用致中毒的病例报告数量有限,因为使用者认为他们摄入的是处方类苯二氮卓类药物,而非强效类似物。Syrjanen等[2]报道多起氯硝唑仑过量服用中毒的案例。一名男性和三名女性在服用苯二氮卓类药物后被送往医院。其中3例出现窦性心动过速,格拉斯哥评分(GCS)为8～13。其中2例经实验室检测氯硝唑仑及其代谢物8-氨基氯硝唑仑,质量浓度分别为0.2～2.1 mg/L和5.9～19.1 mg/L。给予镇静通气治疗,观察恢复正常意识状态。Sommerfeld-klatta等[7]报道一起26岁女性因氯硝唑仑意外中毒而被收治的案例。该女子因患急性支气管炎持续咳嗽难以入睡故服用氯硝唑仑缓解,入院前4 h服用了10 mg 非正规渠道购得的氯硝唑仑粉剂,超过了推荐剂量的20倍。该患者无慢性病,之前未服用任何精神活性物质。患者急性中毒后表现为持续深度昏迷,窦性心动过速(100～110 次/min)。入院后在医院实验室进行的初步毒理学试验显示,通过免疫学定性试验检测到尿液中存在苯二氮卓类药物,GC-FID在血液中未检测出乙醇。LC-MS/MS分别检测4,8,12 h节点血液中氯硝唑仑质量浓度,分别为0.077,0.015和0.009 mg/L。经过治疗,患者出院后无任何后遗症,无精神障碍也无成瘾表现。

氯硝唑仑中毒致死者,死亡机制与氯硝唑仑引起的脑部和呼吸抑制作用一致。尸体检验可见大脑有明显的水肿表现,脑回变宽脑沟变窄;肺脏表现为中度肺充血和水肿,气管和支气管内有大量泡沫状液体;肝脏、脾脏等脏器异常改变不明显[33]。在未知氯硝唑仑的情况下,实验室检测具有难度。尸体检验后采集死者静脉血、尿液送检进行毒物检测。Moore等[33]报道首例单独过量服用氯硝唑仑致死的案例。14岁男性在服用大量阿普唑仑后,次日发现已经死亡。法医学尸体检验以及病理分析结果确定大脑和呼吸抑制符合急性氯硝唑仑中毒的死亡机制。在最初的血液检测中未检出苯二氮卓类药物,包括预期的阿普唑仑。在收到苯二氮卓类药物的假阳性结果后,使用LC-MS/MS对氯硝唑仑的代谢物8-氨基氯硝唑仑进行检测,结果显示死者血液8-氨基氯硝唑仑的质量浓度为140 ng/mL。

除中毒外,还可导致氯硝唑仑相关毒品促成的性侵害案件发生。Skov等[34]在2022年的一项全球药物辅助性侵犯的回顾性研究中统计,存在3起使用氯硝唑仑达成的性侵害案件。

4 总结与展望

苯二氮卓类策划药的滥用逐渐引起人们的关注。由于动态NPS市场的快速更新,常用的快速筛查精神活性药物的免疫测定往往无法检测到NPS;LC-MS/MS或GC-MS检测结果谱图可能不包含最新的NPS,在很大程度上导致漏检。NPS市场的日益复杂突出了不断加强检测、识别和定量此类物质的最先进分析策略的必要性。因此,使用多种检测手段综合检测是鉴别此类化合物的关键。除此之外,涉及药物辅助性侵害案件中,对可疑化合物的准确分析检测结果至关重要,应对侦查人员或医务人员进行培训,充分调查案情,及时收集受害者的生物检材进行检查。同时,对此类药物检测的数据谱图应及时更新并添加到相关检索数据库,可以更快地进行识别,对相关案例的汇总分析同样有助于确定当前的药物趋势,并为临床治疗以及毒物检测提供参考。