基于自增强型互穿聚合物网络凝胶的中药缓释体系的构建与表征

朱日然,丁波,丁胜勇,黄超*,张雅楠

(1.山东中医药大学附属医院药学部,山东 济南 250014;2.烟台市食品药品检验检测中心,山东 烟台 264035;3.山东大学生物医学传感工程技术研究中心,山东 济南 250100;4.山东大学齐鲁医学院第二医院药学部,山东 济南 250033)

骨关节炎(osteoarthritis,OA)被认为是最常见的关节慢性疾病之一[1]。全球约15%的人口患有OA,患者通常持续出现关节疼痛、肿胀和僵硬等症状,严重限制正常活动,给生活带来巨大的负担[2-5]。中医药作为一种已经应用和演进了数千年的治疗体系,以其整体性和系统性的方式在慢性病的预防和治疗中显示出独特的优势[6-8]。有研究证明,张仲景《伤寒论》记载的中医经典方剂-芍药甘草汤(Shaoyao Gancao Decoction,SGD)对骨关节炎有明确的缓解和治疗作用,这为OA的治疗提供了中国特色方案[9-11]。然而,SGD的使用通常依赖传统给药方式(主要是汤剂),这些传统药物制剂往往生物利用度偏低,这一定程度上限制了对OA的治疗效果[12]。因此,有必要进一步探索新型中药制剂,以更好地治疗OA。

近期,基于微纳米材料的药物递送系统受到广泛的关注,已经探索和开发了一系列新型药物载体,包括纳米/微球、微胶囊、纳米乳液和囊泡系统[13-16]。然而,这些药物递送系统通常载药量有限,且一般不具备原位和缓释治疗能力,这难以满足OA长效治疗的需求。水凝胶是由水溶性聚合物链交联形成的网络状半固体材料[17-19]。得益于丰富的网络隔室和可调的网络密度,水凝胶不仅可以装载大量的药物,还可以实现药物的持续释放[20-23]。特别是一些温敏性水凝胶能根据温度的变化显著改变其流变学性能,使其具有可注射性和原位胶凝性[24-26]。但是常见的温敏水凝胶通常存在机械强度不足的问题,这会导致水凝胶过早崩解。虽然可以引入一些化学交联剂,通过形成共价键来提高机械强度,但这些化学交联剂通常表现出一定的毒性[27]。因此,仍有必要开发具有足够机械强度的无毒温敏水凝胶,以期实现中药的定位、高载药量和缓释递送。

本文提出了一种用于中药定位和缓释递送的自增强型互穿聚合物网络水凝胶(SR-IPNH)体系,由泊洛沙姆聚合物网络和甘草酸(glycyrrhizinic acid,GA)超分子网络交联而成。本体系中GA展现了独特的双功能特点:①GA作为SGD的抗炎成分,对OA具有显著的治疗作用[28];②GA以高纵横比自组装成纳米纤维结构,并与泊洛沙姆网络中相互渗透,使温敏水凝胶机械强度显著提高[29-31]。本研究成功制备了上述体系,并对其关键性能,包括流变性、凝胶性、体外可注射性、载药量、体外释放行为及稳定性作了考察。并且参照稳定性研究结果推荐了SR-IPNH的储存条件。我们希望SR-IPNH能为中医药治疗OA提供新的方法和思路。

1 仪器与材料

泊洛沙姆407和泊洛沙姆188(山东优索化工科技有限公司);芍药苷和甘草酸(西安昊轩生物科技有限公司);乙腈(色谱纯,上海星可高纯溶剂有限公司)。冰醋酸和甲酸[色谱纯,阿拉丁试剂(上海)有限公司];氯化钠和硝酸钾(西陇科学股份有限公司)。所有其他使用的试剂均为分析纯。所有溶液使用超纯水(18.2 MΩ·cm)制备。

2 方法

2.1 泊洛沙姆温敏凝胶(PTG)的制备及优化称取泊洛沙姆置入烧杯中,用双蒸水润湿并搅拌,然后在4 ℃冰箱中储存24 h以上,直至得到澄清透明的溶液。随后探究泊洛沙姆188和泊洛沙姆407的含量(泊洛沙姆188:0%、2%、4%、6%、8%;泊洛沙姆407:16%、18%、20%、22%、24%)对胶凝温度(GT)的影响,并采用星点设计(CCD)响应面法研究泊洛沙姆188和泊洛沙姆407的最佳配比。通过Design-expert 11软件,以GT为因变量,以P407(A,%,w/w)和P188(B,%,w/w)为自变量,最后通过试验结果对拟合结果进行验证。

2.2 胶凝性能拍摄并记录凝胶在加热(25 ℃至37 ℃)和冷却(37 ℃至25 ℃)时的颜色和状态变化。取2 mL PTG移入试管中,置于4 ℃水浴。插入精密温度计后,以1 ℃·min-1的速度缓慢加热试管。每隔15 s,将试管倾斜90度,当凝胶不再流动时,将精密温度计的读数记录为GT。将结果平行测定3次,取其平均值。

与GT的测定类似,将2.0 mL的PTG放入5.0 mL的塞式试管中,并将其置于37 ℃的恒温水浴中。每10 s将试管快速倾斜90度。记录的时间为液体不能流动时的胶凝时间。平行测定胶凝时间3次,取其平均值。

2.3 SR-IPNH的制备将GA溶于60 ℃的水中,冷却后,在磁力搅拌下与PTG[P407、P188含量分别为18%、4% (w/w)]混合均匀,制备得到SR-IPNH。研究不同GA浓度(0.5%、1%、3%、5%)对IPN水凝胶溶胀性能和凝胶时间的影响,获得最佳GA浓度。

2.4 SGD浸膏的制备SGD浸膏按《伤寒论》记载制备。将12.0 g白芍和12.0 g炙甘草浸入至300 mL双蒸水中并加热。将溶液煮沸后,缓慢加热30 min。过滤后,将药渣在300 mL双蒸水中加热25 min。再次过滤溶液,并将两份滤液放在一起,最后蒸发得到SGD浸膏。

2.5 高效液相色谱检测将0.2 g浸膏用70%乙醇溶解在烧杯中,并在倒入10 mL容量瓶中后进行定量。摇晃并过滤后,使溶液通过0.45 μm微孔滤膜。用70%乙醇制备对照品溶液,其中芍药苷含量为0.88 mg·mL-1,GA含量为0.72 mg·mL-1。所有溶液均采用波长为250 nm的HPLC法测定,HPLC的流动相条件见表1。

表1 HPLC测量的流动相条件

使用芍药苷和GA浓度分别为0.05～0.88 mg·mL-1和0.04～0.72 mg·mL-1的参考溶液评估线性关系。制备SGD浸膏,分别检测芍药苷、GA含量。

2.6 含SGD的SR-IPNH的制备根据前面的结果,测定SGD浸膏中芍药苷、GA的含量,在SR-IPNH中加入适量的芍药苷、GA,制备出含SGD的SR-IPNH。简言之,将P407 (1.68 g)和P188 (0.25 g)放入烧杯中,并在搅拌下加入适量双蒸水。将混合物在4 ℃冰箱中储存24 h以上,得到澄清透明的溶液(溶液A)。然后,将GA (0.10 g)溶于60 ℃水中,待溶液冷却至室温后,与芍药苷(0.20 g)混合(溶液B)。最后将溶液A、溶液B在磁力搅拌下混合均匀,加入双蒸水至处方总重量10 g,得到P407为16.77%、P188为2.52%、GA为1%、芍药苷为2%的热敏IPN。所有基质浓度均按w/w计算。

2.7 流变性研究将2 mL PTG和SR-IPNH分别置于板直径为60 mm的流变仪板测量模具上。在旋转模式下进行静态剪切速率扫描。在振荡模式下进行应变和频率扫描。

在旋转模式下,剪切速率设定在0.1～100 s-1范围内,分别在25 ℃和37 ℃下测量了样品的黏度-剪切速率曲线。在应变扫描的振荡模式下,扫描频率设置为1 Hz,应变范围为0.01%～100%。分别在25 ℃和37 ℃测定试样的储能模量G′和损耗模量G′随应变的变化范围,确定试样在线性黏弹性范围内的应变条件。在动态频率扫描的振荡模式下,扫描频率设置为0.1～100 Hz。分别在25 ℃和37 ℃下测量凝胶样品的G′、G″和损耗因子tan δ随频率的变化曲线。

2.8 药物载量研究准确称取芍药苷对照品1.71 mg、GA对照品1.44 mg,溶于2.0 mL 70%乙醇中。制备芍药苷1.98 mg·mL-1、GA对照品1.10 mg·mL-1的混合对照品贮备液。然后,将0.5 g载有SGD的SR-IPNH超声处理,使其完全溶于10 mL 70%乙醇中。通过HPLC对制备的溶液进行检测。进样体积为20 μL,波长设置为250 nm。

2.9 体外释放研究将透析袋切成3×3 cm小段,沸水煮10 min,活化后形成半透膜。最后用双蒸水洗去半透膜。向接收池中加入搅拌器。半透膜放置在接收池和供应池之间并固定牢固。向接收罐中加入适量生理盐水,将扩散罐置于37 ℃水浴中,以300 r·min-1的速度预平衡30 min。然后将1.0 g荷载SGD的SR-IPNH或原料水溶液均匀覆盖在供水池的半透膜表面,并用保鲜膜将供水池密封。分别在0.5、1、2、4、6、8、10、12和24 h采集1 mL样本。每次采集样本后,加入相同体积和温度的生理盐水。将收集的药液通过0.45 μm微孔滤膜过滤,采用HPLC法对芍药苷、GA含量进行定量。药物累积释放速率(Q)由下式计算,通过绘制累积释放速率与时间关系图绘制体外释放曲线。

Q=(CnV+∑CiVi)/Q0×100%

V是释放介质的体积,Q0是药物剂量,Cn是在N时间点采集的样本的测量浓度,Vi是在I时间点采集的样本的体积,Ci是在I时间点采集的样本的测量浓度。

2.10 稳定性研究分层试验中,将两份SR-IPNH分别在25 ℃和37 ℃下保持20 min。以3 000 r·min-1离心5 min,观察有无分层。

在确定凝胶温度试验中,称取同批SR-IPNH (5 g)放入西林瓶中密封,置于4、25、37 ℃恒温烘箱中,分别于第0、5、10天采集标本。待样品恢复至室温后,观察温敏凝胶的外观,并测定凝胶温度及芍药苷、GA的含量。

在高湿度试验中,称取相同批次的SR-IPNH (5 g)并置于无塞西林瓶中。将样本置于室温下相对湿度为75%±5%和90%±5%的容器中,分别于0、5、10 d取材观察凝胶外观,并测定GT、芍药苷、GA含量。

光照试验中,称取同批SR-IPNH (5 g),置于西林瓶中密封。置于室温、强光条件下。第0、5、10天取材,观察凝胶外观,测定GT,芍药苷、GA含量。

2.11 可注射性和体外胶凝能力为考察可注射性,在室温下通过直径为0.5 mm的针头挤出1.0 mL含SGD的SR-IPNH,并将挤出压力设定为渗透标准。

在研究体外胶凝能力之前,向1 mL SR-IPNH中加入0.01 mg罗丹明B粉末。采用相同方法制备罗丹明B水溶液。将两种溶液注入37 ℃水中,观察溶液在水中的状态,并对结果进行拍照和记录。

3 结果

3.1 GA与泊洛沙姆的交联原理分析泊洛沙姆是由聚环氧乙烷(PEO)和聚环氧丙烷(PPO)组成的三嵌段聚合物。其胶凝性能主要取决于亲水PEO与疏水PPO的比例,其中PEO为亲水端,PPO为疏水端。当温度达到临界相变温度时,泊洛沙姆分子形成具有疏水核的亲水壳胶束结构,从液态转变为半固态凝胶。

GA结构中含有丰富的羟基和羧基,且其分子间相互作用较弱。同时泊洛沙姆是含羟基的高分子聚合物,因此推测GA与泊洛沙姆之间的氢键是促进两个网络交联的关键。GA网络和泊洛沙姆网络通过氢键力交联,使得凝胶的网络更加稳定,得到的凝胶力学性能也有所提高。GA与泊洛沙姆的交联机理如图1所示。

图1 GA与泊洛沙姆的交联原理示意图

3.2 配方优化采用中心组合设计-响应面法优化泊洛沙姆407、泊洛沙姆188和GA 3种交联剂的浓度。

采用Design-expert 11软件,以胶凝温度(T)为因变量,以P407用量(A,%,w/w)和P188用量(B,%,w/w)为自变量。检测不同条件下的胶凝温度(见表2),计算多元模拟方程。方程为T=29.58-6.70A+2.65B-0.70AB+0.88A2+0.85B2(P<0.000 1,R2=0.991,CV=2.44%)。

表2 CCD-RSM的试验安排和结果

该模型对试验拟合程度高,预测结果的可靠性和可重复性好。根据回归方程的系数,各剂用量对胶凝温度的影响为P407>P188。等高线图和三维响应面图如图2～3所示,等高线接近椭圆,响应面斜率较小,颜色变化相对较慢推断P407与P188交互作用对胶凝温度没有显著影响。

图2 P407和P188相互作用的等高线图

3个预测处方验证结果见表3,3个处方的标准差均小于2.00%,说明拟合模型的预测结果可靠。考虑到辅料用量的减少,最终处方选择16.77% P407、2.52% P188。

表3 不同条件下的胶凝温度

不同GA含量下的溶胀状态和凝胶时间,结果见表4。结果表明,随着GA含量从0增加到3%,胶凝温度逐渐降低。当GA含量增加到5%时,体系几乎不胶凝,这可能与GA胶束与泊洛沙姆网络过度交联有关。当GA含量不超过1%时,凝胶溶胀状态良好,当GA含量超过1%时,凝胶溶胀变得困难。为增加载药量,选择1%作为SR-IPNH制备的最佳GA含量。

表4 甘草酸含量对溶胀情况和胶凝温度的影响

3.3 流变学流变性能可用于表征水凝胶的力学性能。通过测试储能模量G′、损耗模量G″、损耗因子tan δ随剪切频率的变化来评估水凝胶体系的力学性能。流变性还用于通过测定其黏度与剪切速率的关系来评估凝胶的可注射性。

如图3所示,在25 ℃、37 ℃条件下,加入1% GA前后,随着剪切速率的增加,PTG黏度迅速下降。由此可见,加入1%甘草酸对25 ℃(见图4A)和37 ℃(见图4B)PTG性质无影响,均为假塑性非牛顿流体。另外,在25 ℃下加入1%甘草酸后,凝胶的黏度降低,更有利于凝胶的室温注射。在37 ℃时,2种凝胶的黏度较室温时有所增加,这可能是由于37 ℃时凝胶由液态转变为半固态所致。

图3 P407和P188相互作用的三维响应面图

图4 加入1%GA对25 ℃(A)和37 ℃(B)PTG黏度的影响

G′是材料变形后储存的能量,反映了样品的弹性。G″指材料抵抗变形所消耗的能量,反映了样品的黏性。如图5A所示,25 ℃时,PTG+GA组和PTG组的G′和G″均随着频率的增加而逐渐增加,PTG+GA组的G′显著高于PTG组,这可能是由于GA与泊洛沙姆在室温下发生物理交联,提高了弹性性能所致。然而,G′和G″的值总体上较低,这可能是PTG在室温下变成液体的原因。如图5B所示,在37 ℃时,随着频率的增加,PTG+GA组和PTG组的G′呈增加趋势,而G″呈减少趋势。与25 ℃比较,两组凝胶在37 ℃时G′值显著升高。推测温度达到相变点后,温敏凝胶由液态变为半固态,弹性模量显著增加。在37 ℃时,与PTG组相比,PTG+GA组在0～25 Hz范围内G′较高,在25～100 Hz范围内G′较低。PTG+GA组的G″值在0～100 Hz范围内较低。引入损耗因子tan δ来判断加入1% GA后力学性能是否提高。

图5 加入1%GA对25 ℃(A)和37 ℃(B)PTG弹性的影响

损耗因子tan δ是G″与G′的比值。tan δ越低,系统的弹性比例越大。相反,黏性比例越大。如果tan δ>1,则以黏度为主;如果tan δ<1,则以弹性为主。25 ℃系统见图6A,PTG tan δ在0～63 Hz范围内升高,在63～100 Hz范围内降低。PTG+GA的tan δ随着频率的增加而迅速降低,然后趋于稳定。PTG+GA组的tan δ小于1,显著低于PTG组,表明GA的加入可能在室温下诱导与泊洛沙姆的分子间交联。图6B所示为37 ℃时的系统,PTG和PTG+GA组的tan δ均随着频率的增加而迅速降低,然后逐渐稳定。此外,与室温相比,tan δ值均显著降低,说明温敏凝胶的弹性模量由液相变为半固态的比例较大。PTG+GA组的tan δ也显著低于PTG组,说明添加GA的温敏凝胶在常温下凝胶化后力学性能更好。

图6 加入1%GA对25 ℃(A)和37 ℃(B)条件下tan δ的影响

3.4 胶凝如图7A所示,SR-IPNH在25 ℃时为淡黄色透明液体,逐渐加热至37 ℃后呈半固态。冷却至25 ℃后,由半固态恢复为流动液态。SR-IPNH与SGD的平均胶凝温度为35.1 ℃,推测在人体温度下会发生相变。

图7 A.SR-IPNH在不同温度下的流动性;B.可注射性和体外胶凝能力

如图7B所示,注入37 ℃水中后,罗丹明B水溶液立即溶解并扩散,而被罗丹明B染色的SR-IPNH呈连续线形。这表明含SGD的SR-IPNH可在注射部位快速胶凝。此外,该凝胶表现出良好的可注射性和体外胶凝能力。

3.5 药物荷载GA和芍药苷是SGD治疗OA的有效成分,以其含量为指标考察了SG对SR-IPNH的载药量。采用HPLC法对凝胶中的两种成分进行定量(见图8)。最终工艺制备的SG-SR-IPNH中芍药苷和GA的含量分别为1.88%和0.86%,与SGD中芍药苷和GA的含量一致。

A.阳性对照;B.SR-IPNH 1.芍药苷;2.GA图8 不同样品中芍药苷和GA的HPLC色谱图

3.6 体外释放研究图9A可见,芍药苷在SR-IPNH中24 h累积释放率为51.69%±4.80%,在水溶液(API)中为83.28%±1.26%。水溶液的释放速率在6 h内迅速达到峰值,6 h后几乎停止释放,芍药苷在24 h内的累积释放速率逐渐增大,说明芍药苷能够顺利从SR-IPNH中释放出来,且具有显著的缓释作用。如图9B所示,24 h内GA在SR-IPNH中的累积释放速率为65.88%±2.99%,在水溶液中为84.99%±4.60%。在所有时间点,GA在SR-IPNH中的累积释放速率均显著低于在水溶液中的累积释放速率。说明GA可以能增强温敏凝胶的力学性能,也可以作为药物缓释以达到治疗目的。

图9 芍药苷(A)和GA(B)在不同温度下的体外释放曲线

拟合芍药苷和GA在温敏凝胶中的体外释放度曲线,结果见表5～6。Qt为药物累积释放速率,T为体外释放时间。芍药苷和GA体外释放模型拟合方程的相关系数均为一级>Ritger-Pappas>零级=Higuchi模型,说明一级释放模型最符合芍药苷和GA在SR-IPNH中的释放规律。

表5 芍药苷体外释放模型的拟合方程

在Ritger-Pappas模型中,当n<0.45时,药物符合Fick扩散。当0.450.89时,药物释放机制为骨架溶解。如表5所示,芍药苷释放的Ritger-Pappas模型中n为0.438 9,表明芍药苷的释放主要依赖于自扩散。由表6可知,GA释放的Ritger-Pappas模型中n为0.608 3,说明GA的释放机制是自扩散和凝胶溶解的双重作用。结果表明,芍药苷和GA的释放机制不同,这可能是因为GA在SR-IPNH中既是药物又是交联剂。凝胶的溶解会影响GA的释放。

表6 GA体外释放模型的拟合方程

3.7 稳定性研究在25 ℃和37 ℃离心后,SR-IPNH外观均匀,无分层。4 ℃、25 ℃、37 ℃贮藏10 d后,外观、胶凝温度、指标成分含量均无明显变化。37 ℃保存时,SR-IPNH为半固态,不适合注射用。建议将SR-IPNH储存在4～25 ℃的温度下。含SGD的SR-IPNH在90.5%和75.5%的湿度下储存10 d,外观和凝胶温度无显著变化。90.5%湿度条件下放置10 d后,芍药苷、GA含量无明显变化。而在75.5%湿度条件下,芍药苷和GA含量随着放置时间的延长而增加。75%湿度下指标成分含量的增加可能与凝胶中水的蒸发有关。因此,建议将SR-IPNH置于密封条件下保存。

含SGD的SR-IPNH在强光照射10 d后,外观、凝胶温度和芍药苷含量均无明显变化。随着储存时间的延长,凝胶中GA含量显著降低,说明GA在强光条件下可能不稳定。因此,建议将SR-IPNH储存在暗处。

4 讨论

本研究提出了一种用于中药缓释的自增强互穿聚合物网络水凝胶体系。GA不仅可作为治疗OA的抗炎药物,还可作为增强凝胶力学性能的辅助材料。得益于GA聚合物网络和泊洛沙姆聚合物网络的互穿交联,在不添加有毒化学交联剂的情况下,提高了IPNH的机械强度。制备的SR-IPNH具有良好的成胶性能和流变性,成功荷载中药有效成分,并且实现了药物的定位缓释。此外,稳定性试验表明,室温、密闭和黑暗环境更有利于凝胶的保存。我们期望本研究将对中药治疗OA中提供新的思路和方法支持。