禽副黏病毒1型和禽副黏病毒4型的相关研究进展

2023-11-18 02:18王雪竹伍晔晖陶乔孝慈刘建华
现代畜牧兽医 2023年9期
关键词:毒力致病性基因组

王雪竹,伍晔晖,陶乔孝慈,刘建华

( 1.新疆农业职业技术学院动物科技分院,新疆 昌吉 831199 ; 2.新疆农业大学动物医学学院,新疆 乌鲁木齐 830052 )

禽副黏病毒(avian paramyxovirus,APMVs)是全球禽类感染率最高的重要病毒之一。根据相关报道,APMVs可在迁移的水禽中呈流行性暴发,许多APMVs均是在流感病毒的监测过程中被发现。鸽子、野鸭、双冠鸬鹚是野生鸟类群体中APMVs的重要宿主之一[1-2]。APMVs发病率增加严重制约了家禽业的发展,给家禽养殖业带来了巨大的经济损失。禽副黏病毒1型(avian paramyxovirus type 1,APMV-1)是APMVs中最具特征的病毒,又称新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV),源自英格兰的纽卡斯尔海滨市。1926年,NDV首次从印度尼西亚被发现;1927年,英国新城堡报道了NDV[3]。NDV在全球范围内呈地方性暴发,其传播速度快,宿主范围广,病死率高达90%[4],对家禽养殖业构成一定威胁。禽副黏病毒4型(avian paramyxovirus type 4,APMV-4)1975年首次分离自宰鸭厂[5]。在美国,APMV-4主要分离自水禽,如野鸭、木鸭、赤膀鸭、环颈鸭等[6],且大多是在禽流感的监测过程中被发现。可从实验室感染APMV-4 1 d后的SPF雏鸡肺、气管、胰腺及肠部检测到该病毒[7]。目前除实验室感染鸡可导致轻度间质性肺炎和卡他性气管炎外,APMV-4感染无明显的临床表征[8]。若不能及时控制APMV-1和APMV-4的流行趋势,可能会造成更大的损失,因此,尽早分离和鉴定病原并进行生物学特性研究迫在眉睫。针对上述问题,本研究拟对上述两种病毒的流行现状和特点进行总结,并对其进行分子生物学特性研究,以期为今后临床预防APMV-1和APMV-4提供参考。

1 APMV-1/NDV

APMVs属于副黏病毒科(Paramyxoviridae family)、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus genus),其基因组为不分节段的单股、负链RNA。目前,可通过红细胞凝集抑制试验(haemagglutination inhibition,HI)和神经氨酸酶抑制试验(neuraminidase inhibition,NI)将APMV分为21个血清型(APMV-1~APMV-21)[9],各血清型之间的致病潜力也存在很大差异。不同血清型的APMV与禽类物种不同程度的致病性相关,其中APMV-1是APMVs中最具特征的血清型,能够在鸡群中引起严重的疾病,给家禽养殖业造成了巨大的经济损失。

1.1 病原学

APMV-1基因组结构特征为3'-N-P-M-F-HN-L-5',可依次编码产生6个结构蛋白,包括融合蛋白(fusion protein,F)、大聚合酶蛋白(large polymerase protein,L)、基质蛋白(matrix protein,M)、核衣壳蛋白(nucleocapsid protein,N)、磷蛋白(phosphoprotein,P)和血凝素-神经氨酸酶蛋白(hemagglutination-neuraminidase protein,HN)[10]。此外,NDV基因组在3'末端含有55个核苷酸(nt)前导序列,在5'末端含有114个nt尾序列。

经研究发现,NDV的F蛋白是其致病性的重要决定因素之一,对宿主起到主要保护作用。流感病毒和NDV毒株在其F蛋白裂解位点含有共有序列R/KR-Q-R/K-R↓F,F蛋白裂解位点的共有序列是G/E-K/R-Q-G/E-R↓L,蛋白前体F0至F1-F2亚基是NDV感染性的决定因素。因此,F蛋白切割位点的氨基酸序列假定为NDV毒力的主要决定簇。F基因和HN基因在NDV毒力和致病性中起到主要作用。有研究表明,F基因的免疫原性比HN基因更好,并可诱导NDV的无菌免疫感染。F蛋白的切割位点存在谷氨酰胺残基的保守位点,并且Q114R的突变可导致病毒毒力减弱。此外,病毒的毒力和致病性可通过改变F蛋白调制糖基化位点。由于NDV在野鸭中普遍呈隐性感染状态[11],且病毒颗粒在水中稳定性更强,因此野鸭迁徙也是该病毒远距离传播的途径之一。

1.2 病毒复制

APMV进入宿主细胞,通过糖蛋白(F、HN)在病毒表面上的相互作用及其与细胞表面唾液酸受体的介导结合,使病毒与宿主细胞融合。病毒核衣壳进入宿主细胞质,使负性病毒RNA被转录,通过病毒编码的RNA以依赖性RNA聚合酶的梯度方式,使用宿主细胞机器翻译和折叠病毒蛋白产生mRNA结构。一旦达到N基因mRNA的最佳浓度,则将负向基因组RNA转化为积极的反基因组模板,用于合成新的负性RNA基因组。

1.3 流行病学

鸡非典型新城疫一年四季均可发病,夏季相对高发,病鸡与带毒鸡均是该病的传染源。据调研分析,多数发病鸡为免疫鸡,但病情较为温和[12],不同日龄的鸡感染症状不同。其中,1~2月龄的雏鸡发病率最高,接种免疫4~15 d后和抗体效价较低的成年鸡群易感;产蛋鸡多在产蛋高峰期之前易感[13]。NDV不仅能够感染鸡,也可感染其他禽类,其中火鸡最易感,鸭、鹅均易感,但鸡的病死率最高。

根据致病性可将NDV分为3类:轻毒(低毒力)、中毒性(中等毒力)和强毒性(高毒力)。通过氨基酸裂解位点预测,可根据NDV的毒力基因将其分为嗜内脏型和嗜神经型等两种。1996至2005年间,通过对美国、丹麦、芬兰和瑞典陆续分离的NDV进行同源性分析,发现这些毒株均来自同一池塘的野鸟[14]。鸽群也是该病毒传播的主要媒介之一,带毒体可通过排便及分泌物大范围传播病毒[15]。为更好地防控NDV,世界各地多个国家已制定相应的免疫程序。

1.4 临床症状

鸡新城疫的临床症状差异较大,其严重程度主要取决于感染毒株的毒力、免疫状态、抗体效价、品种日龄、饲养管理水平等因素。感染NDV会损害鸡的特异性免疫系统,鸡血红细胞会出现血凝抑制现象,并抑制细胞表面产生抗体。鸡新城疫可分为典型性和非典型性两种,根据临床症状和发病速度还分为最急性、急性和慢性等3种。一般情况下,自然感染NDV具有3~5 d的潜伏期[16]。患病鸡常伴随呼吸症状、神经症状、急性败血症及黏膜出血等。发病初期,患病鸡出现精神萎靡、羽毛杂乱、食欲废绝、饮欲增加、排黄绿色水样粪便,并伴随轻微呼吸、神经症状;后期症状加重,体温升高至43 ℃,流涎、嗉囊积液,鸡冠肉髯呈紫红或紫黑色,产蛋量下降,瘫痪,重者死亡[17]。

1.5 诊断方法

容敏靖等[18]针对NDV建立结合TaqMan探针的反转录环介导等温扩增技术(RT-TaqMan-LAMP)快速检测方法,验证该方法的特异性、灵敏性和重复性,并与反转录数字PCR(RT-dPCR)方法对比。结果显示,研究建立的NDVRT-TaqMan-LAMP检测方法特异性强、灵敏度高、重复性好,能够有效避免非特异性扩增,可用于NDV的精准检测和流行病预防。王静静等[19]针对国内流行的基因Ⅵ型NDV F基因保守区域设计特异性引物和探针,建立了RT-dPCR方法,并考察了该方法的灵敏度、特异性和重复性。结果显示,建立的方法线性关系良好,灵敏度高,最低检测限为1.97 copies/μL;特异性强,重复性好。仇薪鑫等[20]建立了1种快速鉴别NDV强弱毒株的RT-PCR诊断方法,对传染性法氏囊炎病毒(IBDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)和传染性喉气管炎病毒(ILTV)的检测结果均为阴性,对NDV强弱毒株最小RNA检出量为0.01 mg/L。王通辉等[21]建立了NDV、IBDV和IBV三重RT-PCR检测方法,该方法特异性、稳定性良好。

ELISA试验分为直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等,间接ELISA试验具有时效高、便捷等优点,适用于大范围的临床检测,广泛应用于抗原、抗体的检测[22-25]。索南元旦[26]建立了1种快速检测NDV抗体的间接ELISA诊断方法,灵敏度为1∶12 800,与血凝抑制试验符合率为96.1%。孟凯等[27]采用商品化NDV ELISA检测试剂盒和PCR法对50份临床疑似新城疫病料进行检测,以此验证ELISA检测方法的准确性和优缺点。有研究采用原核表达纯化方法获得建立NDV LaSota株的核衣壳蛋白(NP),将其作为包被抗原建立NDV间接ELISA抗体检测方法,该方法的灵敏度是血凝抑制试验的50倍,组间重复性试验的变异系数小于6%[28]。

1.6 防控

由于我国尚未研制出适用于本土禽类的APMV-1商品化特效药,因此防控APMV-1最好的方法即加强饲养管理,制定科学合理的免疫程序,定期监测鸡群免疫水平。

1.6.1 加强日常饲养管理

日常饲养管理中,保证各阶段鸡群的营养需要,饮水清洁,适当通风,严格把控饲养密度,调节适宜温度、湿度,建立良好的生物安全体系,定期消毒,避免长途运输,减少应激,对病死鸡和淘汰鸡做好分群管理和无害化处理。

1.6.2 制定科学合理的免疫程序

国内新城疫常用疫苗主要有减毒毒活疫苗如VGGA、LaSota、clone30等基因Ⅱ型疫苗株,主要通过滴鼻、饮水及气雾的形式进行免疫。弱毒苗可同时诱导体液免疫和细胞免疫,产生抗体速度快,但抗体效价较低,而且免疫后易诱发呼吸道疾病。灭活苗主要是LaSota株和Ⅶd亚型A-Ⅶ株制备的两种疫苗,虽然免疫抗体效价较高,但速度抗体生成速度较慢[28]。根据鸡群的品种、年龄,养殖场的规模条件、饲养管理水平和该地区APMV-1的流行特点,制定相应的免疫程序。实时监测鸡群APMV-1的免疫状态和抗体效价,提高信息化管理水平。首次免疫在孵化后的5~7 d内进行,采用疫苗滴鼻、点眼的形式;第一次接种15 d后接种第二针疫苗。除滴鼻、点眼外,还可通过饮水的形式给药,注意疫苗量要增加0.5~1.0倍。第2次免疫接种后25 d内进行第3次免疫。呕鸡场规模较小、饲养管理条件较差,可适时进行第4次免疫。

1.6.3 排除其他疫病的影响

免疫接种能够在一定程度上保护鸡群,但要避免疫病传播,就必须采取更严格的措施,如消毒、隔离、封闭等,从而消灭传染源,切断传播途径。养殖场内应注意排除其他疫病的影响,防止鸡群发生鸡马立克氏病、鸡传染性法氏囊病、鸡白痢、鸡慢性呼吸道病等。

2 APMV-4

2.1 病原学

APMV-4属于副禽腮腺炎病毒属,电镜下可观察到病毒颗粒呈圆形,表面有致密的纤突,内部有被囊膜包裹的对称螺旋核衣壳[29]。APMV-4基因组大小为15 054 nt,基因组顺序为3'-N-P/V/W-M-F-HN-L-5',含有6个非重叠基因,共编码6种蛋白(F、L、M、N、P和HN)。其中HN蛋白和F蛋白是构成病毒囊膜表面纤突的2种结构蛋白,在APMV-4的发病过程中起到重要的作用。

2.2 流行病学

全球有8条候鸟迁徙路线,其中有3条途径中国,中国作为候鸟的重要越冬地,有430多种迁徙的候鸟从中国过境种类,占世界的20%~25%[30]。野鸟迁徙生态系统被认为是APMV-4的主要传播途径,野鸟迁徙途中的栖息地是监测野鸟病毒的重要场所。鸟类迁移成为病原体传播扩散潜在威胁,可能影响疾病传播的动态[31]。为更好地进行AMPV-4在全球范围的传播、进化、分布、生态学及流行病学研究,应加强对家禽及野生禽类种群的监测。

2.3 临床症状

蛋鸡自然感染APMV-4会出现白壳蛋产量增加的现象,无其他明显临床症状。实验室感染APMV-4可导致禽类出现轻度间质性肺炎和卡他性气管炎[7],症状于感染后的5~9 d最明显,之后逐渐恢复,且无其他明显临床表征。NDV与APMV-2是APMVs中导致禽类发病的主要血清型,由于APMV-4 F1亚基的N端与NDV强毒株、APMV-2相同,由此推测APMV-4也存在强致病性的可能[32]。

2.4 检测方法

2.4.1 分子生物学检测

APMV-4常用的分子生物学检测方法有普通PCR、q PCR、RT-PCR等。其中RT-PCR的操作相对准确、简便,在国内外常用于病毒初期感染诊断和病毒的分离鉴定。2008年,Nayak等[33]对APMV-4鸭/香港/D3/75株的完整基因组进行了测序,并对含胚鸡蛋进行检测,分析其致病性。2014年,王静静等[34]建立了APMV-4荧光RT-PCR检测方法。2017年,杨金兴等[30]建立了特异性区分APMV-1和APMV-4的一步法RT-PCR检测方法。张慧敏等[7]利用RT-PCR法对APMV-4新疆分离株的基因组进行了扩增,并对该毒株进行了遗传进化分析。

2.4.2 血清学检测

常用的APMV-4血清学检测方法有HA与HI试验、ELISA试验、间接免疫荧光、免疫组织化学等。实验室常用HA-HI试验进行病毒的初步鉴定,该试验方法具有操作方法简单、检测成本低廉的优点。由于APMV-4感染细胞不产生明显的细胞病变(CPE),HA-HI试验对于APMV-4病毒滴度的测定具有重要意义。Alexander等[35]通过HAHI试验,发现APMV-4分离株与NDV毒株存在低水平的单向交叉反应。张慧敏[7]利用HA-HI试验,发现APMV-1的阳性血清在一定程度上可抑制APMV-4出现血凝现象,这一试验结果与Alexander等[35]研究一致。

2.5 防控

通过实验室研究发现,感染APMV-4并没有明显的临床表征,目前国内用于APMV-4的鉴别诊断技术甚少,也没有太深入的研究。我国尚未研制出适用于本土禽的APMV-4的商品化疫苗与特效药。

3 禽副黏病毒的生物学进展

反向遗传学系统是一种强大的技术,通过该技术,感染性病毒可通过克隆DNA产生,并可提供预期修饰及将其引入病毒基因组。从cDNA克隆中回收重组APMVs,有助于了解更多APMV基因及其蛋白质的结构和功能。目前,APMV-1病毒载体已应用于疫苗的开发和研制,APMV-2~APMV-4、APMV-7和APMV-9还可作为减毒病毒载体开发的候选物[36]。APMV-1和APMV-9对鸡的致病性得以确定[37],现已深入探讨重组NDV的生物学功能,并单独对其疫苗效价进行审查。有研究显示,APMV-4中F蛋白切割位点的突变率增加会促进细胞感染、复制及形成合胞体。值得注意的是,APMV-7在细胞培养中不形成合胞体或噬斑,改变融合切割位点中的单个氨基酸可增加其细胞病变。

4 结论

APMVs是世界各地家禽业的主要威胁之一,在许多地区呈地方性感染。特别是APMV-1在鸟类物种间存在不同程度的感染,其毒力和致病性不断循环。目前,APMV-1~APMV-4和APMV-7的反向遗传学研究为更好的探索其生物学的意义奠定了研究基础。但对于APMVs的生物学特性、流行率以及其对感染家禽的实际影响还有待进一步探究。此外,了解不同APMVs的完整基因组序列并调查流行病学可为后期疫苗研发做准备。

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