双条拂粉蚧基因组DNA提取方法的比较和优化

王宇航，孟秀利，黄山春，林兆威，宋薇薇，唐庆华，覃伟权

（1. 海南大学 植物保护学院，海口，570228; 2. 中国热带农业科学院 椰子研究所/海南省槟榔产业工程研究中心，海南 文昌，571339）

双条拂粉蚧（Ferrisia virgataCockerell）属半翅目（Hemiptera）、粉蚧科（Pseudococcidae）昆虫，刺吸式口器。该虫以寄生植物，吸食植物叶片或果实的汁液存活，其适应性较强。双条拂粉蚧作为一种重要的热带农林害虫在世界上分布和寄主植物都非常广泛，并且双条拂粉蚧还是可可肿枝病毒（Cacao swollen shoot virus，CSSV）和槟榔黄叶病毒病1（Areca palm velarivirus 1，APV1）等病毒病的传播媒介昆虫[1-2]。该虫还是一种进境水果检疫性粉蚧[3]。鉴于双条拂粉蚧昆虫在传播病原方面的多样性及其对热带作物的危害性，研究该虫基因组DNA提取优化方法，可以在分子实验基础上建立后续的昆虫防治[3]等方面的研究，也可为后续研究双条拂粉蚧作为槟榔黄化病媒介昆虫的病原检测提供高质量DNA。

植原体（Phytoplasma）是一种主要通过媒介昆虫传播、存在于植物韧皮部及媒介昆虫的肠道、淋巴及唾液腺等组织内的原核生物[4-6]。近年来，随着植原体对世界范围内对许多经济作物造成的严重减产，对植原体病害也进行了更广泛的拓展研究[7]。目前中国是发现植原体病害最多的国家，至今已报道100多种植原体病害，由植原体侵染引起的病害如枣疯病、甘蔗白叶病、槟榔黄化病等[8]可造成严重的经济损失。在海南，植原体侵染引起的槟榔黄化病（Areca palm yellow leaf disease，YLD）是一种毁灭性病害，每年因该病造成的经济损失高达20亿以上[9]。

本研究团队在槟榔黄化病媒介昆虫的研究中，前期发现双条拂粉蚧体内携带植原体，推断该虫可能为槟榔黄化病的媒介昆虫，但想要更细致研究媒介昆虫的单头虫接种以及如何使病原分子检测更精确，在采集昆虫样本进行基因组DNA提取时，防止DNA降解以及如何从体型微小的单个虫体提取足量的DNA是至关重要的[10]。为了获得高质量的双条拂粉蚧基因组DNA，提高植原体的检出率，本研究采用3种研磨方法与2种试剂盒进行组合，对不同数量和不同保存时间的双条拂粉蚧进行了基因组DNA提取实验，确定最优能够获取提取单头双条拂粉蚧昆虫高浓度基因组的提取方法，为后续媒介昆虫的验证实验提供基础和依据。

1 材料与方法

1.1 实验用虫 所需实验用虫是中国热带农业科学院椰子研究所植物保护中心饲养的双条拂粉蚧3龄成虫。当天采集的活体双条拂粉蚧（A处理）和经95%酒精浸泡并在-20 ℃冰箱保存7 d后的双条拂粉蚧（B处理）用于DNA提取试验。

1.2 试剂盒及实验器材 TIANGEN血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（货号DP304-03，TIANGEN，中国，以下简称TIANGEN试剂盒）、QIAGEN DNeasy Blood & Tissue Kit（货号69506，QIAGEN，德国，以下简称QIAGEN试剂盒）2种试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。用于组织研磨的Servicebio KZ-III-F型高速低温组织研磨仪购自武汉赛维尔生物科技有限公司，金属研磨杵同样购自天根生化科技（北京）有限公司，不锈钢钢珠（直径5 mm）购自鼎特尔钢球有限公司。超微量紫外光分光光度仪（Q5000型，Quawell，美国）购自上海洪纪仪器设备有限公司。

1.3 不同保存时间和数量的蚧虫基因组DNA提取方法 以双条拂粉蚧3龄成虫为实验材料，分别采用TIANGEN、QIAGEN 2种试剂盒进行基因组DNA提取。每种试剂盒分别采用研磨杵单独研磨、研磨仪单独研磨、研磨仪+研磨杵3种方法进行提取前研磨。各组合如下：（1）研磨杵+QIAGEN试剂盒；（2）研磨仪+QIAGEN试剂盒；（3）研磨杵+研磨仪+QIAGEN试剂盒；（4）研磨杵+TIANGEN试剂盒；（5）研磨仪+TIANGEN试剂盒；（6）研磨杵+研磨仪+TIANGEN试剂盒。将当天采集（A处理）和预处理（B处理，用灭菌水将经95%酒精浸泡的昆虫冲洗3次，用吸水纸吸干昆虫体表的水）后的1、3、5、7和10头双条拂粉蚧放入灭菌2.0 mL离心管中；QIAGEN试剂盒先加入裂解液ATL和蛋白激酶K、TIANGEN试剂盒先加入裂解液GA和蛋白激酶K。研磨杵手动研磨后按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。研磨方法换为研磨仪，则在放有粉蚧的离心管中加入2粒直径为5 mm的钢珠，放入研磨仪研磨，参数设置为60 s/120 Hz，研磨2次。研磨后再进行DNA提取。研磨方法为研磨杵+研磨仪，先将离心管中的粉蚧用研磨杵手动研磨，再在离心管中加入2粒钢珠，放入研磨仪（60Hz，120s）研磨，2次研磨后按照基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA。提取的DNA于-20 ℃保存。

1.4 DNA电泳 将5 μL样品DNA与1 μL溴酚蓝混合进行点样，分子量标记采用Marker 2000。电泳用1%琼脂糖凝胶，1 × TAE电泳缓冲液，电压120 V，室温30～40 min，凝胶成像系统获取凝胶图谱进行分析。

1.5 实验数据分析 所有实验数据用微量紫外分光光度仪测定提取基因组DNA的OD值和浓度值。采用SPSS 26.0进行统计软件正态性和方差齐性检验，采用平均值±标准差（Mean ± SD）表示，进行单因素方差分析，P＜0.05与P＜0.01分别表示差异显著与极显著。使用Adobe Photoshop 2022（V23.5.1）进行实验电泳照片的编辑处理。

2 结果与分析

2.1 6种提取方法下不同数量和保存时间的蚧虫DNA浓度比较 6种提取方法下不同数量和保存时间的蚧虫DNA浓度比较结果（表1、表2）表明，双条拂粉蚧材料无论是A处理还是B处理均可完成基因组DNA的提取。在2种试剂盒中，TIANGEN试剂盒在使用研磨杵和研磨仪研磨虫体后提取的DNA浓度更高（P＜0.05），尤其是用1或3头成虫进行提取，例如用1头粉蚧进行提取，TIANGEN试剂盒搭配研磨杵+研磨仪获得的浓度是QIAGEN试剂盒相同条件下的1.2倍～1.5倍。本实验数据还显示，2种试剂盒均呈现随粉蚧数量增加获得的DNA浓度逐渐升高的趋势，在10头昆虫提取时获得的DNA最高，2种不同处理下3组样品平均值分别为185.43、148.23 ng·μL-1。B处理提取的基因组DNA浓度不如A处理，所以建议在采集双条拂粉蚧样品后尽量当天进行基因组提起以获得相对高浓度的DNA，如不能当日提取也可酒精浸泡保存，并尽量在双条拂粉蚧提取时选择多头数提取。

表1 6种方法提取当天采集蚧虫基因组DNA浓度（A处理）

表2 6种方法提取经95%酒精浸泡7 d后蚧虫基因组DNA浓度（B处理）

2.2 6种提取方法下不同数量和保存时间蚧虫DNA质量比较 对A处理当天采集的双条拂粉蚧进行基因组DNA提取，然后测定OD值。根据2种试剂盒的说明书，提取的基因组DNA样品的A260/A280通常在1.9左右代表样品基因组DNA提取质量比较高，蛋白质、酚类及多糖杂质去除的比较完全。OD值如果大于正常范围则表示提取的DNA样品中有RNA污染；小于正常范围说明含有少量蛋白质及酚类物[11]。表3和表4显示，TianGen研磨杵+研磨仪法整虫提取法在A处理和B处理双条拂粉蚧提取基因组DNA的OD值远优于其他方法，OD值均为1.80～1.95。能提出较好的基因组DNA质量。其他方法组提取的OD值均为1.95～2.20，OD值大都偏高说明DNA含有杂质。

表3 6种方法提取当天采集蚧虫基因组DNA纯度（A处理）

表4 6种方法提取经95%酒精浸泡7 d后蚧虫基因组DNA纯度（B处理）

2.3 6种提取方法DNA电泳图的比较 选用了2种适用于昆虫基因组DNA提取的试剂盒及3种不同研磨方法提取双条拂粉蚧的基因组DNA，然后采用琼脂糖凝胶电泳检测提取的DNA完整性。电泳后条带清晰明亮，说明DNA提取方法较好、浓度和纯度相对较高[12]。凝胶电泳结果（图1）表明，不同提取方法对DNA完整性影响不同，6种方法获得的DNA均有一定程度的降解。A处理（当天采集双条拂粉蚧）6种方法提取样品DNA均在2 000 bp以上区域有明显条带（图1-Ⅰ）。B处理(20 ℃中经95%酒精浸泡7 d后)QIAGEN试剂盒法和使用研磨杵的TIANGEN试剂盒法所提DNA电泳无明显条带、条带亮度较弱（图1-Ⅱ），这表明保存7 d后的蚧虫基因组DNA会降解并且这几种方法提取的DNA产率不高。总体来看，使用研磨仪+研磨杵+TIANGEN试剂盒法所提DNA完整性最好，跑胶条带最为清晰。

图1 双条拂粉蚧基因组DNA电泳图

3 讨 论

本实验以B处理的20℃冷藏用95%酒精浸泡7 d后的双条拂粉蚧作为实验材料，在数量较少时（1或3头），基因组DNA的浓度较低，其OD值与A处理当天采集昆虫样品提取的基因组DNAOD值相差不大，这表明酒精保存并没有对基因组DNA的质量产生较大影响。但用单头粉蚧进行提取时，无论用哪种研磨方法或试剂盒，提取的DNA浓度均低于A处理当天采集的粉蚧样品提取的DNA。因此，采集的粉蚧样品若当天或2 d内无法进行DNA提取时，不建议用酒精冷冻保存过长时间，因为这可能对后续PCR扩增（如虫体内植原体检测）产生一定影响。

近年来试剂盒法在各实验领域的应用越来越广泛，试剂盒提取方法也在不断优化更新，其目的都是利用优化的试剂盒法更快速、简便、高效地提取基因组DNA。因此，对于粉蚧类小型昆虫，基因组DNA提取多采用高效快速的试剂盒法[13-15]，试剂盒法在提取昆虫时对样品的虫数要求较少，且不需要其他特殊的试剂和实验器材，简单、省时，大大提高了对样品基因组的提取效率。近年来，不同实验室使用试剂盒法进行DNA提取与纯化中的应用越来越多。例如，黄凤兰等[16]使用优化条件后的试剂盒法，通过对提取过程中处理条件优化，优化后提取出的基因组DNA质量更高。何衍彪等[17]和陈哲等[18]用DNA抽提试剂盒法成功提取扶桑绵粉蚧和12种粉蚧的基因组DNA，并且试剂盒法提取的基因组DNA质量能很好地支持后续的分子鉴定、基因序列比较等实验。周梦月等[19]在几种提取方法比较实验中发现使用试剂盒法所得DNA进行PCR扩增的成功率最高。在试剂盒法的优化DNA提取过程中，多是采用裂解条件、裂解时间[20]、洗脱液的用量等优化方法。在实验前处理的研磨方法上研究较少，本实验在研磨方法上提出改良，也为后续研究其他DNA提取方法优化提供参考。

昆虫基因组DNA提取的关键步骤之一是对实验用虫虫体的破碎，常用的就是研磨杵、研磨仪、液氮研磨等研磨方法。对于双条拂粉蚧这种小型昆虫的破碎，笔者在前期实验过程中发现，在用液氮研磨时，由于昆虫较小，在研钵中研磨后昆虫组织并不易收集。但若单用研磨杵研磨双条拂粉蚧，因为虫体柔软没有太坚硬外骨骼，研磨时由于虫体翻滚使得研磨杵不便于着力，导致短时间较难将整虫研磨好，但长时间研磨可能会导致基因组降解。所以本实验最终选择的研磨杵+研磨仪的双研磨方式既解决了昆虫组织不易收集的问题, 又使得基因组不在长时间研磨后被自身的核酸酶降解。

本研究结果为后续进行槟榔黄化病区采集的双条拂粉蚧样品进行病原植原体检测（尤其是田间粉蚧数量较少情况下样品的检测）以及带“毒”双条拂粉蚧接种验证等研究奠定了基础。