地塞米松冲击疗法对犬抗氧化及免疫功能的影响

苑君君, 吴佳颖, 李 艳, 周 进, 陈 浩, 贺绍君

(安徽科技学院 动物科学学院,安徽 凤阳 233100)

地塞米松(Dexamethasone,Dex)是一种人工合成的糖皮质激素,给药途径广泛,包括内服、静脉注射、关节腔内注射、肌肉注射和外用。近几年,Dex冲击疗法在临床上得到了广泛的应用,主要用于治疗自身免疫性疾病、血液系统疾病等,具有良好的效果,但其对机体的利害双重效应表现得极其复杂且不易平衡,如使用剂量不当将带来毒副作用[1]。Dex是一种免疫抑制剂,主要通过抑制、激活促炎细胞因子(IL-1、IL-6、TNF-α)和抗炎细胞因子(IL-4、IL-10、IL-13)来影响免疫功能。陈岚[2]研究报道,高剂量Dex冲击疗法治疗原发免疫性血小板减少症时,可以明显缩短治疗时间并提高治疗效果,且不会对患者的睡眠状况造成任何影响。Dex可安全有效地用于犬咀嚼肌肌炎的治疗,35%的犬出现轻微的免疫介导的炎症副作用,随着Dex剂量逐渐减少而逐渐缓解[3]。Dex通过上调Nrf2表达、增加抗氧化酶水平减轻实验性自身免疫性脑脊髓炎小鼠的氧化损伤[4]。Giles等[5]发现Dex可诱导未成熟的脾细胞和胸腺细胞凋亡,诱导免疫抑制,并引起骨骼肌细胞、成骨细胞、胰腺细胞等多种细胞的氧化应激。此外,动物遭受冷热、手术及心理等应激时,血浆中糖皮质激素增加,易引起氧化应激。本试验通过对中华田园犬肌注高剂量Dex,测定犬血清抗氧化及免疫功能相关指标的变化,并分析其变化意义,为客观评价临床上应用Dex进行冲击疗法提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选用8只免疫完备、个体差异小且健康的成年中华田园犬,平均体质量为5 kg,在安徽科技学院实验动物中心犬舍单笼饲养。试验周期为7 d,每天08:30采集试验犬颈静脉血5 mL,静置30 min,3 000 r/min离心15 min,分离血清,-80 ℃下保存备用。第2～5天09:00肌注Dex(2 mg/kg·BW),第6～7天仅采血,所采血样依次为肌注前1天、肌注Dex 4 d及恢复2 d。

1.2 药品及主要仪器

地塞米松磷酸钠注射液(江苏涟水制药有限公司)。HH3-DK8D恒温水浴锅(江苏优卓诺仪器制造有限公司);HI650-W台式高速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);DHP-9052B电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);Thermo Fisher Multiskan Go型全波长酶标仪(美国Thermo有限公司)。

1.3 试验动物的饲养管理

试验开始7 d前对试验犬进行驱虫,犬舍温度为(28±1) ℃,空气相对湿度为65%±5%,自由采食、饮水。试验开始前测量其体温为(38.8±0.2) ℃,呼吸频率为(41.20±9.5) 次/min,心率为(101.4±10.4) 次/min。犬粮的营养水平见表1。

表1 犬粮的营养水平

1.4 测定项目

1.4.1 犬血清氧化还原指标 采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定犬血清总抗氧化能力(T-AOC),超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,丙二醛(MDA)、维生素C、维生素E、巯基、总羰基、一氧化氮(NO)和8-羟基脱氧鸟苷含量,测定方法参照试剂盒说明书进行。

1.4.2 犬血清免疫指标 参照试剂盒说明书检测血清中免疫球蛋白A(IgA)、免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白G(IgG)、补体3、γ-干扰素(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、C-反应蛋白(CRP)含量。所用试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.5 数据的统计分析

采用PASW Statistitics 18.0统计软件,对试验数据进行单因素方差分析,结果用“平均值±标准差”表示,P<0.05表示差异显著,P>0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 Dex对犬血清抗氧化指标的影响

2.1.1 Dex对犬血清T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性及维生素C、维生素E与巯基含量的影响 由表2可知,与肌注前相比,肌注Dex第1天T-AOC显著升高(P<0.05);第1～4天及恢复1 d血清的SOD活性显著降低(P<0.05);第3天CAT活性显著下降(P<0.05);第1～4天维生素E含量显著上升(P<0.05),第1～3天及恢复1 d巯基含量显著上升(P<0.05)。各试验时间点GSH-Px活性、维生素C含量未发生显著变化(P>0.05)。

表2 Dex对犬血清T-AOC、SOD、GSH-Px、CAT活性及维生素C、维生素E与巯基含量的影响

2.1.2 Dex对犬血清总羰基、8-OHdG、NO以及MDA含量的影响 由表3可知,与肌注前相比,肌注Dex第1天总羰基含量显著下降(P<0.05),第3～4天及恢复期1～2 d显著上升(P<0.05);肌注Dex第3～4天NO含量显著下降(P<0.05)。与肌注前1天相比,各试验时间点8-OHdG、MDA含量未发生显著变化(P>0.05)。

表3 Dex对犬血清总羰基、8-OHdG、NO以及MDA含量的影响

2.2 Dex对犬血清免疫指标的影响

由表4可知,与肌注前相比,肌注Dex第1天IgM含量显著升高(P<0.05),第4天显著降低(P<0.05);第3～4天及恢复1～2 d的IgG含量显著降低(P<0.05);第2～4天及恢复2 d的IgA含量显著降低(P<0.05);第3天C-反应蛋白显著降低(P<0.05)。与肌注前1天相比,各试验时间点补体3、IFN-γ、IL-2含量未发生显著变化(P>0.05)。

表4 Dex对犬血清免疫指标的影响

3 结论与讨论

T-AOC常用来反映机体总体抗氧化能力水平。El-senousey等[6]研究表明注射Dex可使肉鸡血浆、肝脏和脾脏中T-AOC水平显著降低。本试验中,犬注射Dex第1天T-AOC显著升高。推测在肌注Dex前期药效未充分发挥作用,机体短时间内通过增强抗氧化酶活性以抵御氧化损伤。Dex主要通过激活JNK或P38MAPK信号通路诱导机体氧化应激[7],此外,Dex诱导的氧化应激能够激活MAPK→Nrf2→ARE通路调节抗氧化酶(SOD和GST)的表达及活性,从而引起机体发生代偿生理变化以抵抗自由基的侵害。第2天后犬血清T-AOC与肌注前相比无明显差异,可能是由于机体在经过第1天氧化状态后血液中的SOD和GSH-Px活性与体内自由基达到平衡状态,T-AOC无显著变化。

SOD是生物体内氧自由基清除系统的重要防线,主要存在于线粒体中。Lyu等[8]研究表明,肉鸡长期饲喂Dex可导致机体SOD活性降低,产生氧化应激。本试验中,犬在注射Dex第1天后血清SOD活性显著降低,与上述结果一致。机体内的自由基逐渐积累并引起氧化应激,SOD作为机体抗氧化的第一道防线,当活性氧过量产生,导致SOD消耗过多,其活性降低。CAT能有效清除体内的过氧化氢,使其免受过氧化氢的损害。Eid等[9]研究发现,经过Dex处理的蛋鸡血清中CAT活性显著降低。本试验中,第3天犬血清CAT活性显著降低,与上述研究结果一致。说明Dex冲击疗法会降低犬血清内抗氧化酶的活性,降低机体抗氧化能力。CAT活性在前期没有显著变化,而到第3天才显著降低,可能是由于前期SOD发挥作用将超氧阴离子自由基转化为过氧化氢,然后CAT进一步使过氧化氢分解为分子氧和水。表明大量有害自由基会消耗机体内的抗氧化剂,从而使抗氧化酶的活性降低。GSH-Px是重要的过氧化物酶,具有保护细胞结构和功能完整性的作用。Kim等[10]研究表明过量Dex处理小鼠可导致肌肉GSH-Px活性显著下降。本试验中肌注Dex后犬血清GSH-Px活性无显著差异,与上述试验结果略有不同。机体在遭受氧化应激时SOD和CAT在体内率先发挥作用,对GSH-Px起到保护作用。VC、VE是非常重要的抗氧化剂[11]。陈渠等[12]研究发现山羊注射0.2 mg/kg Dex血浆中VE、VC含量均无显著变化。本试验中,VE含量显著上升,停止注射后恢复正常,与上述结果不同。可能是由于机体为缓解氧化应激带来的危害动员自身VE贮备,保护机体免受氧化性损伤,从而使VE含量与肌注前相比显著增加。总羰基主要反映蛋白质功能是否正常。Pan等[13]研究表明,Dex处理使肉鸡胸肌羰基含量显著增加,蛋白质降解加剧。本试验结果与上述结果一致。Dex通过增加蛋白质分解率降低蛋白质合成速率,并大量产生ROS,自由基进一步攻击蛋白质氨基酸骨架及侧链使其发生羰基化,犬机体内羰基含量增加,进而使蛋白质功能下降。

IgA、IgG、IgM和补体是哺乳动物免疫系统过程中免疫的主要成分。Min等[14]研究发现,种公鸡皮下注射4 mg/kg Dex后,血清IgM含量和ND抗体滴度均显著下降,机体免疫功能下降。Qi等[15]研究表明长期大剂量Dex注射降低了小鼠脾脏中免疫球蛋白的含量。本试验中,接受Dex处理的犬血清免疫指标总体呈下降趋势。第1天IgM含量显著升高,IgM是机体首次发生免疫应答的抗体,后续阶段IgM含量降低,可能是由于免疫过程中IgM被大量消耗,导致其含量降低。肌注Dex后IgA、IgG含量显著降低,且恢复2 d后仍处于一个较低的水平,Dex可能阻碍了犬免疫系统抗体的分泌,降低了免疫球蛋白的合成,且对不同种类的免疫球蛋白合成的影响不尽相同,机体免疫功能降低。IL-2和IFN-γ是一类分子质量较小的可溶性多肽,在免疫应答和炎症反应的启动及调节过程中发挥重要作用。IL-2通过促进动物机体分泌免疫球蛋白和释放IFN-γ,IFN-γ促进抗体的生成,增强机体免疫功能。本试验结果提示,Dex降低犬血清IL-2和IFN-γ水平,这解释了免疫球蛋白可能分泌过少而导致免疫球蛋白含量降低,机体的免疫功能降低。CRP为常见的炎症因子,该指标水平能反映机体炎症状态。本试验肌注Dex后,第1天CRP含量上升,提示犬可能受到炎性疾病的影响,机体氧化应激失衡,大量的氧自由基对机体组织产生攻击,抗氧化酶活性持续降低,从而使炎症反应进一步加深。

综上,肌注Dex会改变犬血清总抗氧化能力、氧化还原物质含量,且会导致机体蛋白质降解,从而改变犬血清氧化应激状态,并显著降低机体的免疫功能。在临床上应用高剂量的Dex应严格把控用药剂量、时间,并及时纠正氧化还原状态,调节免疫水平。