微波-超声协同提取香樟叶精油及抗菌活性研究

刘西岭, 郭俊芳, 程 楠, 李 娜, 喻明军*

(1.亳州学院 生物与食品工程系,安徽 亳州 236800;2.亳州学院 中药学院,安徽 亳州 236800)

香樟(Cinnamomumcamphora(L.) Presl.),又名芳樟、樟木、番樟和血樟等,是国家二级重点保护野生植物,主要分布于丘陵、平原等地带[1]。香樟的根、枝、叶和果实均可入药,具有止痛、消炎、化痰、止咳和创伤治疗等作用[2-3]。香樟精油主要含有松油烯、乙酸肉桂酯、异樟醇和柠檬烯等成分,具有抗菌、抗癌、抗氧化和抗炎等作用,广泛用于香料、医药和化工等领域[4-7]。

香樟精油提取方法主要包括水蒸气蒸馏法(Hydrodistillation,HD)、超临界CO2萃取法、酶解-超声辅助提取法、微波辅助提取法和无溶剂微波萃取法等[8-10]。周艳平[11]研究了水蒸气蒸馏提取香樟精油,最佳提取率为3.42%。秦国正等[12]报道了超临界CO2法提取香樟叶精油,萃取率在最佳工艺条件下为10.2%,明显高于水蒸气蒸馏法,提高了3.42%,但提取成本高。Liu等[9]报道无溶剂微波提取香樟精油,并与直接水蒸气蒸馏法进行比较,发现微波无溶剂法的提取率较水蒸馏法高(3.51% vs 3.35%),且节约提取时间。在精油提取中,细胞壁是阻碍精油提取的重要因素,破坏细胞壁加速精油向溶剂中扩散,有利于提高精油提取率和提取效率[13]。超声波的机械和空化作用以及微波的穿透性能够快速破坏细胞壁,进而加快精油向溶剂中扩散,从而提高精油的提取率[14-16]。在香樟叶精油提取中直接水蒸气蒸馏法时间长,精油提取率偏低,而超临界CO2法虽然提取率高但提取成本也高。本研究基于微波和超声能够破坏细胞壁的特点,采用微波-超声辅助提取香樟叶精油,提高香樟叶精油的提取率,并节约提取时间,通过GC-MS分析微波-超声处理法提取的精油和未处理精油的组分之间的差异,并比较其抗菌活性。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

香樟叶采自亳州市,采摘时间为4月份,其他试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

QJ-04型粉碎机(拜杰有限公司);SCIENTZ-IIDM微波光波超声波萃取仪(宁波新芝生物科技有限公司);GCMS-TQ8040 NX气相色谱-质谱联用分析仪(日本岛津有限公司)。

1.2 香樟叶精油提取方法

1.2.1 原料预处理 将采摘于亳州学院的新鲜香樟叶用水清洗,自然晾干,粉碎,过50目筛。

1.2.2 香樟叶精油的提取 采用微波-超声协同提取法(Microwave-ultrasonic Synergistic Hydrodistillation,MUHD):称取10.0 g香樟叶粉末,置于圆底烧瓶中,加入3%氯化钠溶液。在微波光波超声波萃取仪中,先进行微波处理,然后进行超声处理。微波-超声结束后,在水蒸馏提取精油装置中回流提取4 h。用5 mL乙酸乙酯对精油提取仪进行洗涤,再用适量无水硫酸钠进行干燥处理,室温减压浓缩除去乙酸乙酯,得到淡黄色的油状液体,即香樟叶精油。直接水蒸气蒸馏提取(HD):称取10.0 g香樟叶粉末,置于圆底烧瓶中,加入3%氯化钠溶液,在水蒸馏提取精油装置中回流提取7 h。用5 mL乙酸乙酯对精油提取仪进行洗涤,再用适量无水硫酸钠进行干燥处理,室温减压浓缩除去乙酸乙酯,得到香樟叶精油。

1.2.3 香樟叶精油组分分析 采用气质联用仪对香樟叶精油进行成分分析。气相色谱条件:SE-30弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μL),FID检测器温度为280 ℃,进样口温度为280 ℃;色谱柱程序升温条件为初始温度50 ℃,保持2 min,以3 ℃/min升至120 ℃,保持3 min,再以20 ℃/min升至260 ℃,保持10 min,共运行45 min,载气为高纯度氮气,进样量为0.1 μL,分流比为50∶1[17]。质谱条件:EI-MS,离子源温度为180 ℃,接口温度为260 ℃,扫描范围为40～650 m/z,溶剂延迟3 min[17]。利用面积归一法定量分析各组分的含量,通过NIST 14谱库检索对各组分进行定性分析。

1.2.4 微波-超声条件优化 为获得香樟叶精油的最佳提取工艺条件,根据单因素试验平均结果,利用Design Expert 12软件,依据 Box-Behnken 组合试验设计原理,通过单因素试验筛选的超声功率、微波功率和液料比等3个显著影响因素,设计三因素三水平响应面优化试验(表1)。

表1 响应面因素水平设计

1.2.5 香樟叶精油抗菌活性试验 采用滤纸片扩散法检测香樟叶精油对大肠杆菌(CICC23657,中国工业微生物菌种保藏管理中心)的抑菌效果,具体步骤参照姚小平等[18]的方法。香樟叶精油经吐温-80稀释成500、250、125、62.5 μg/mL,然后检测抑菌圈的大小。

1.2.6 统计分析 使用GraphPad Prism 8.0软件进行数据处理和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 提取工艺对香樟叶精油提取率的影响

2.1.1 液料比对精油提取率的影响 液料比是影响精油提取率的重要因素[19-20]。如图1所示,香樟叶精油提取率先随着液料比的增加而增加,在液料比为20∶1时达到最大,随后再增加溶液,精油提取率稍微降低。

图1 液料比对精油提取率的影响Fig.1 Effects of liquid-material ratio on yield of essential oil extraction

2.1.2 微波-超声功率对精油提取率的影响 试验结果显示,先微波再超声的提取率高于先超声再微波的提取率。因此,试验考察了微波-超声预处理对香樟叶精油提取率的影响。微波和超声功率对香樟叶精油提取率的影响如图2所示。微波时间为3 min时,香樟叶精油提取率先随微波功率的提高而提高,在500 W时达到最大值,在600 W时稍微降低,而到700 W时精油提取率降低明显(图2A)。在超声时间为20 min时,超声功率对香樟叶精油提取率的影响也比较明显(200～500 W),精油提取率在300～400 W时提取率最高,低于300 W和高于400 W时提取率明显降低(图2B)。

图2 微波功率和超声功率对精油提取率的影响Fig.2 Effects of microwave power and ultrasonic power on the yield of essential oil extraction

2.2 响应面试验及结果

2.2.1 响应面试验 为获得香樟叶精油的最佳提取工艺条件,根据单因素试验结果,依据Box-Behnken 组合试验设计原理,以香樟叶精油的提取率为响应值,以液料比、微波功率和超声功率为考察因素,分别用A、B、C表示,然后根据模拟出的17组试验,进行试验获得相应结果(表2)。由表2可见,提取率的实际值和预测值差异较小,说明模型可靠性较强。利用Design-Expert 12软件得到二次回归模拟方程为Y=4.11+0.080 0A+0.131 3B+0.096 3C-0.055 0AB-0.100 0AC-0.057 5BC-0.171 8A2-0.204 2B2-0.079 3C2。由表3可知,模型的F为41.61,P<0.000 1,差异显著,表明此模型具有统计学意义。失拟项F为0.36,P为0.786 8,大于0.05,说明此模型可用于描述各项提取工艺条件与香樟叶精油得率的关系。此外,比较表3的F值可知,微波功率对香樟叶精油提取率的影响最大,其次为液料比,最后为超声功率。通过比较P可得A、B、C、AC、A2、B2、C2对香樟叶精油得率的影响极显著(P<0.01)。模型相关系数为0.981 7,说明模型的拟合度和可信度较高,调整后R2为0.958 1,表明影响香樟叶精油提取率的变化量有95.81%来自模型中变量,且与预测R2(0.915 1)的差异小于限值20%,表明模型可靠(表4)。变异系数为1.10%(小于5%),表明方程回归性较好。精密度为19.548 4(大于4),表明该模型具有足够明显的信号可用于优化。图3中响应曲面和等高线呈马鞍形和椭圆形,表明微波功率、超声功率和液料比之间交互作用对香樟叶精油提取率的影响显著。因此,在试验因素可控范围内,此模型可用于分析和预测微波-超声辅助水蒸气蒸馏提取法对香樟叶精油的提取效果。

图3 响应曲面和等高线图Fig.3 Response surface plots and contour plots

表2 Box-Behnken试验设计和结果

表3 香樟叶精油响应面方差分析

表4 模型的可信度分析

2.2.2 最佳工艺条件验证 响应面法模拟的最佳工艺条件:液料比为20.946 7∶1,超声功率为389.486 W,微波功率为576.856 W,此时提取率为4.15%。为方便进行验证,对参数进行取整,液料比为21∶1,超声功率为390 W,微波功率为575 W,验证试验3次。香樟叶精油提取率平均为4.12%±0.11%,与响应面法模拟的预测值4.15%相近。

2.3 香樟叶精油组分分析

微波-超声辅助水蒸气蒸馏法和直接水蒸气蒸馏法得到的香樟叶精油的主要化学成分如表5所示,总离子峰如图4所示。从表5可以看出,微波-超声辅助水蒸气蒸馏法提取的香樟叶精油分析检测出40种化合物,高于直接水蒸气蒸馏法提取的36种化合物。与直接水蒸气蒸馏提取法相比,微波-超声协同提取的精油樟脑含量明显降低(60.61% vs 76.84%),而橙花叔醇(11.71% vs 3.38%)、异戊烯酸(6.88% vs 1.86%)、1,8-桉叶油素(1.71% vs 0.23%)和双环大牛儿烯(0.91% vs 未检出)含量相较直接水蒸气蒸馏提取则明显上升。说明不同的提取方法对精油的成分存在一定的影响[21]。

图4 香樟叶精油总离子流图Fig.4 Total ion chromatogram of Cinnamomum camphora leaves essential oil

表5 香樟叶精油的组分分析

2.4 香樟叶精油的抗菌活性

大肠杆菌广泛存在于自然界,是一种常见的致病菌,具有易培养致病性低的特点。已报道多种精油,如香樟精油、罗勒精油和百里香精油等对大肠杆菌具有较好的抑制效果[22-26]。香樟叶精油对大肠杆菌的抑制效果如图5所示,精油质量浓度在62.5 μg/mL时抑菌圈小于10 mm,抑菌效果不明显,当精油质量浓度增加到125 μg/mL时,抑菌圈直径大于10 mm,表现出明显的抑菌活性。微波-超声协同辅助水蒸气蒸馏提取的精油对大肠杆菌的抑制作用略高于直接水蒸气蒸馏提取的精油。

图5 香樟叶精油对大肠杆菌的抑制效果Fig.5 Inhibition effects of Cinnamomum camphor leaves essential oil on Escherichia coli

3 结论与讨论

本研究采用微波-超声辅助水蒸气蒸馏法提取香樟叶精油,通过单因素试验和响应面法对预处理条件和提取方法进行优化,得到最佳提取工艺条件:液料比为21∶1 (mL∶g),超声功率为390 W,微波功率为575 W。精油提取率为4.12%±0.11%,相较水蒸气蒸馏提取法(3.42%)和微波无溶剂提取法(3.51%)有明显提高。微波-超声辅助法提取的精油组分较直接水蒸气蒸馏提取法提取的精油明显增加,且樟脑含量明显降低,而橙花叔醇、异戊烯酸和1,8-桉叶油素含量明显增加。抗菌活性试验表明,微波-超声辅助法提取的精油对大肠杆菌的抑制作用高于直接水蒸气蒸馏法提取的精油。