桃红四物丸制备工艺的优化及抗氧化作用

汪盈盈, 冯学花, 许婉君

(1.安徽中医药科学院 亳州中医药研究所,安徽 亳州 236800;2.亳州职业技术学院,安徽 亳州 236800;3.安徽新华学院,安徽 合肥 230088)

桃红四物汤出自清代柴得华所著的《妇科冰鉴》。处方为“生地三钱(酒洗),当归四钱(酒洗),白芍钱五分(酒炒),川芎一钱,桃仁十四粒(去皮尖研泥),红花一钱(酒洗),水煎温服。”该方具有养血活血,祛瘀生新的功效[1-2]。现代研究表明,桃红四物汤剂具有调经镇痛、活血化瘀、抗炎等多种药理作用[3-4],临床上主要用于治疗淤血阻滞引起的头晕目眩、月经不调、淤血疼痛、经行腹痛、损伤肿痛等症状的疾病[5]。该方位列国家中医药管理局首批公布的百首经典名方之中。但传统汤剂具有口感差、煎煮不便、病人顺应性差等缺点,丸剂是中药传统剂型,具有药物崩解缓慢、逐渐释放药物、延长药物作用时间、减少药物不良反应、携带方便、适用于慢性病的治疗等优点。本试验采用现代提取和制丸技术制成丸剂——桃红四物丸,结合桃红四物汤的功效——活血祛瘀兼具养血,以及中医理论对丸剂的理解——“丸者缓也,舒缓而治之”,适合一些病情缓而需要调养和巩固疗效者,丸剂更能保持传统方剂的“原汁原味”,更适合作为“桃红四物汤”的新剂型,现采用响应面法优化制备工艺,为后期新药开发提供相关参考[6-7]。

除传统功效外,现代研究表明,桃红四物汤有一定的抗炎、保护神经、降血脂、抗氧化等作用[8]。桃红四物汤中的芳香酸类、苷类等成分是其发挥抗氧化作用的主要物质基础[9]。桃红四物汤水煎液的抗氧化作用对血瘀症的缓解有一定意义[10],且氧自由基涉及桃红四物汤所应用的妇科、内科、骨伤科以及养生等多个领域的病理机制[11]。探讨桃红四物丸的抗氧化活性对进一步阐释该方临床应用起到重要作用。

1 材料与方法

1.1 仪器

YUJ-10A型台式中药制丸机(天水华圆制药设备科技有限责任公司);ZXFD-B5040恒温鼓风干燥箱(上海智城仪器制造有限公司);电子秤(上海友声衡器有限公司);KQ-500E型超声波清洗器(昆山市超声波仪器有限公司);800Y多功能粉碎机(永康市铂欧五金制品有限公司);80、100目筛(浙江上虞杜浦联江纱筛厂)。

1.2 药品与试剂

当归、熟地、川芎、白芍、桃仁、红花等6味药材均购于安徽新兴中药材饮片有限公司,经亳州职业技术学院陈娜副教授鉴定为正品。无水硫酸钠、硫酸亚铁、石油醚、过氧化氢、邻二氮菲等均为分析纯,购于国药集团化学试剂有限公司。

1.3 方法

1.3.1 制丸方法筛选 桃红四物方中桃仁、川芎油性大,遇水不成形,故塑制法制备丸剂不易控制和操作,成型性不理想,制丸参数不易控制。因此采用泛制法制丸。

1.3.2 桃红四物丸原料的制备 按处方称取白芍和熟地,粉碎,过100目筛,置干燥器皿中保存。按处方称取当归、川芎、桃仁、红花,采用前期提取工艺的最优方案(液料比为6∶1,50%乙醇旋转蒸发2 h,得干膏),以水为黏合剂,采用泛制法制丸。

1.3.3 制备工艺单因素筛选 根据单因素预试验初步结果及有关研究资料[12],以固定赋形剂-水作为前提,以同一批桃红四物干膏为原料,恒定其它工艺参数,以外观、丸剂含水量、溶散时间和丸质量差异为评价指标[13],在其他条件不变的情况下,以药材粉粒度(A)、干燥时间(B)、干燥温度(C)为考察因素筛选最佳工艺(表1)。采用综合加权评定的方法计算OD值[14],OD=外观质量评价×20%÷外观质量评价最高分+丸剂含水量最低值×30%÷丸剂含水量+溶散时限最低值×30%÷溶散时限+丸质量差异最低值×20%÷丸质量差异。

表1 单因素水平

1.3.4 响应面试验设计 在单因素预试验的基础上,以药材粉粒度(A)、丸剂的干燥时间(B)、丸剂的干燥温度(C)为考察因素,按照响应面法设计原理,考察因素为3个水平,用数值-1、0、1表示,具体见表2。

表2 试验因素和水平

1.3.5 羟自由基清除率测定[15]在试管中依次加入50 μL 2.30 mol/L FeSO4·7H2O溶液、50 μL 2.30 mmol/L磷酸盐溶液、50 μL 2.30 mmol/L邻二氮菲溶液、50 μL不同浓度桃红四物丸的95%乙醇溶液,最后加入0.16%过氧化氢溶液,混合均匀,37 ℃下水浴加热1 h,于536 nm处测定吸光度A1,0.16%过氧化氢溶液用同体积蒸馏水代替测定A2,95%乙醇溶液用同体积的蒸馏水代替供试品的测定吸光度A0,以VC溶液(抗坏血酸)作为对照,计算供试品的羟自由基的清除率[16-17]。

2 结果与分析

2.1 单因素考察结果与分析

2.1.1 药材粉粒度对桃红四物丸制备的影响 如图1所示,药材粉粒度在80目时综合评分最高,80目前后综合评分呈下降趋势。因此选择60、80、100目为响应面优化考察范围。

图1 药材粉粒度对综合评分的影响Fig.1 Effects of particle size of medicinal powder on comprehensive score

2.1.2 干燥时间对桃红四物丸制备的影响 如图2所示,干燥1 h时综合评分最高。干燥时间短,不易贮藏,干燥时间长,则会导致药片中有效成分含量下降,故经过综合考量,将1.0、1.5、2.0 h为响应面优化考察范围。

图2 干燥时间对综合评分的影响Fig.2 Effects of drying time on comprehensive score

2.1.3 干燥温度对桃红四物丸制备的影响 如图3所示,随着干燥温度的升高,综合评分上升较快,50 ℃下达到峰值,因此选择30、50、70 ℃为响应面优化考察范围[18]。

图3 干燥温度对综合评分的影响Fig.3 Effects of drying temperature on comprehensive score

2.2 响应面法优化桃红四物丸的制备工艺

2.2.1 响应面试验设计及方差分析 在单因素预试验的基础上,以药材粉粒度(A)、丸剂的干燥时间(B)、丸剂的干燥温度(C)为考察因素,采用Design-Expert 8.05b软件设计Box-Behnken响应面,对相关数据进行分析[19]。由表4可知,回归模型P<0.000 1,R2=0.923 3。表明采用此方法进行桃红四物丸提取工艺的预测和分析具有可行性。所得的回归方程如下:Y=91.00-1.77A+0.35B-0.91C-3.21AB-4.66AC+3.90BC-0.91A2-3.21B2+4.66C2。回归方程式的显著性显示:A具有高显著性、B和C不具有显著性;在交互性项目中AC值有显著性;在二次项中,C2具有高显著性,B2有一定显著性(表3～4)。

表3 制备工艺响应面试验设计与结果

表4 方差分析

2.2.2 响应面图谱与分析 根据数据和模型绘制响应曲面3D图(图4)。采用Design-Expert 8.05b软件[15]对单因素试验和二次回归模型进行综合分析[15-20],获取最佳制备工艺:药材粉粒度为70目,干燥时间为1.75 h,干燥温度为55 ℃。在此条件下,综合评分达到最大值。为了方便应用于工艺生产中,优化后桃红四物丸的最佳制丸工艺为:药材粉粒度为80目,干燥时间为1.75 h,干燥温度为55 ℃。在此条件下,综合评分达到最大值。

图4 因素交互作用对综合评分影响的响应曲面图Fig.4 Response surface diagram of the influence of factor interaction on comprehensive score

2.2.3 验证试验的结果分析 为进一步考察响应面法的可靠性,按照处方称取药材3份,每份共51 g,按最佳制备工艺进行验证试验,观察外观并测定水分含量、丸质量差异以及溶散时限[16]。试验表明,每个批次的水分含量、丸质量差异、外观以及溶散时限都接近于响应面法最优数据的理论值,因此采用响应面法优选的桃红四物丸的制备工艺切实可行(表5～6)。

表5 工艺技术验证试验

表6 制备试验验证试验

2.3 羟自由基清除率测定

由图5可以看出,Vc对羟自由基的清除能力比桃红四物丸高,用PASW Statistics 18.0软件处理试验数据,结果显示,Vc对羟自由基的EC50=4.54 mg/mL,桃红四物丸对羟自由基的EC50为5.56 mg/mL。

图5 羟自由基清除率测定结果Fig.5 Determination of hydroxyl radical scavenging activity

3 结论与讨论

桃红四物丸的水分含量、溶散时限与制备过程中的诸多因素有关,其中药材粉碎度对溶散时限的影响最大,药材不同的粉碎程度影响水分渗透的速度,进一步影响丸剂的溶散时限,通过响应面法考察,药材粉碎度在70目,丸粒的溶散时间最短。通过响应面法优化制备工艺,采用多元回归方程,将试验设计与统计分析相结合,将所选择的各因子与反应值之间的关系用数学模型表达,并进行数值模拟,得到了更为准确、可靠的结果,与传统的正交试验法相比,响应面法所需的试验次数减少、试验时间缩短,回归公式的准确性也更高,从而更有利于寻找不同因子的最优组合。所以,本研究采用了单因素筛选和响应面法优化,使得试验设计更合理、方案最优。即药物粉粒度为80目,干燥时间为1.75 h,干燥温度为55 ℃。

桃红四物丸对羟自由基的EC50为5.56 mg/mL,对羟自由基具有较强的清除能力,抗氧化作用较好,与其活血化瘀、抗凝等效应共同改善血瘀症状的整体疗效,对于临床应用有一定的指导意义,为桃红四物丸在传统功效之外的开发利用提供理论依据。