响应面法优化蜂蜜酿酒工艺条件及风味的分析研究

黄 莎，陈 琳，杨动听，汪 昕，杨 选，王晔洋，李伟荣*

（1.丽水市农林科学研究院，浙江丽水 323000；2.丽水市质量检验检测研究院，浙江丽水 323000）

蜂蜜酒是世界上最早的酒精饮料，在公元五世纪至六世纪之间人们凭借经验实践制作蜂蜜酒，并将之储存于瓦罐中。近几年蜂蜜酒非常受欢迎[1]。蜂蜜酒采用稀释蜂蜜，经发酵过滤澄清得到，酒精度不高[2]。目前，蜂蜜酒酿造工艺存在两大问题，一是蜂蜜酒发酵酒精度不高，周期长达数周甚至几个月，因蜂蜜成分和发酵菌种的不同而有所差异[3]，酒精度不高使得蜂蜜酒不耐贮藏，发酵周期长使得商业化的生产成本增加，不利于蜂蜜酒的产品化开发；二是蜂蜜酿酒过程中产生不良风味，使得蜂蜜酒品质难以满足人们对愉悦感受的追求[4]。

导致蜂蜜酒发酵酒精度不高、时间长的原因，一是蜂蜜自身的问题，蜂蜜的高渗透压抑制大部分微生物的生长，蜂蜜缺乏酵母生长所需的营养物质如氮源和矿物质；二是与发酵的菌种及发酵温度有关，菌种抗性能力的强弱、适应性的好坏、接种量以及发酵温度与发酵进程和成品品质密切相关[5]。蜂蜜酒的风味来自于蜂蜜本身、酵母发酵及发酵工艺[6]。挥发性香气物质对蜂蜜酒品质起着决定性的作用，不良风味的产生严重影响蜂蜜酒的品质。据研究报道，蜂蜜酒的不良风味物质主要来自于发酵不完全导致的二次发酵，蜂蜜酒的不良风味与乙酸乙酯、辛酸和己酸的含量有关，这些挥发性物质导致蜂蜜酒感官品质下降，尤其是香气和味道[7]。还有研究者发现用于发酵的菌株对酒的风味有影响，不恰当的菌株有可能会产生异味[8]。本研究拟通过研究酵母菌种、酵母接种量、氮源、氮源添加量、蜂蜜稀释度、pH 值等单因素条件对蜂蜜酒的影响，结合响应面法优化工艺解决蜂蜜发酵酒精度不高及发酵过程产生不良风味的问题。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

样品及菌种：枣花蜜（波美度42 ºBx），浙江丽水蜂农；AQ 酿酒酵母，安琪酵母股份有限公司；LMD 酿酒酵母，憨酒匠自酿坊，原产国丹麦；DBS酿酒酵母，烟台帝伯仕酵母有限公司；

试剂及耗材：纯净水；(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、维生素B1，食品级，广东顺达食品配料城；其他检测用试剂均为分析纯试剂（AR）或生物试剂（BR）。

仪器设备：BSA224S 电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司；T9CS 双光束紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；pH 计，梅特勒-托利多；糖度计，上海力辰邦西仪器科技有限公司；气相色谱仪，7890 安捷伦科技有限公司；Trace 1300-ISQ QD 气质联用，安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 纯蜂蜜酿酒操作步骤

蜂蜜稀释：按蜂蜜和水的质量比加纯净水稀释，并搅拌均匀，采用手持折光仪测定糖度，单位为ºBx。

加氮源：蜂蜜中缺乏酵母生长繁殖所需的足够氮源[9-10]，需将外源氮源(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4、维生素B1 等加入蜂蜜稀释液中，并搅拌均匀，才能使发酵进行彻底。

灭菌和冷却：将配制好的蜂蜜营养液置于80 ℃水浴保温20 min，起到杀灭有害微生物的作用，冷却至30 ℃左右。

加酵母：将酵母置于35 ℃左右含2%的蔗糖水溶液中活化约20 min，将活化好的酵母菌加入灭菌冷却好的蜂蜜营养液中。

发酵：将接种好的蜂蜜营养液置于适宜温度下发酵1个月左右。

澄清：将发酵液静置一段时间，直至发酵液完全澄清，取澄清发酵液即得到蜂蜜酒成品。

1.2.2 发酵工艺单因素试验设计

试验研究不同酵母菌种、不同接种量、不同氮源、不同氮源添加量、不同蜂蜜稀释度、不同pH 值对纯蜂蜜发酵酒的影响，评价指标有蜂蜜酒酒精度和感官评分。

1.2.3 发酵工艺响应面优化试验

在单因素试验结果的基础上，自变量选取A 酵母接种量、B 氮源添加量和C 蜂蜜稀释度，响应值为X 酒精度和Y 感官评分，采用Box-Behnken 响应面试验法优化发酵条件[11]，3因素3水平见表1。

表1 纯蜂蜜酒发酵条件优化响应面试验因素与水平

1.2.4 分析检测

蜂蜜酒酒精度的测定参照GB 5009.225—2016执行[12]；蜂蜜酒糖度采用手持折光仪进行测定，单位为ºBx；总糖、总酸和挥发酸参照GB/T 15038—2006 执行[13]；甲醇的测定参照GB 5009.266—2016执行[14]；卫生指标金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的测定参照GB 4789.10—2016[15]和GB 4789.4—2016[16]执行。

1.2.5 感官评价

蜂蜜酒感官评价参照行业标准QB/T 5475—2020 执行[17]，将酒样水浴调温至20～25 ℃，取酒样注入洁净透明的玻璃杯中进行感官评价。外观与色泽：在自然光亮处，用肉眼观察酒样的外观与色泽，色泽及深浅、透明度和澄清度、有无沉淀及悬浮物；香气：手握杯柱，将酒杯置于鼻孔下方，嗅闻挥发香气，然后慢慢摇动酒杯，嗅闻空气进入后的香气，加盖用手握酒杯腹部2 min，摇动后再嗅闻香气；滋味：喝入适量酒样，仔细品尝后咽下，再体会后味[18]，最后根据表2评分标准[19]进行打分。

表2 蜂蜜酒感官评价标准

1.2.6 风味物质的检测

风味物质的检测参照何瑞的略做修改[20]，取样品6 mL 加入到萃取瓶中，密封好后插入萃取针，50 ℃恒温萃取40 min后插入进样口解析4 min。

气相色谱条件：色谱柱为DB-5MS（30 mm*0.25 mm，0.25 μm）；载气氦气，流速1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；升温程序：42 ℃保持4 min，以10 ℃/min 升至90 ℃，保持2 min，再以8 ℃/min 升至130 ℃，保持2 min，最后以10 ℃升至240 ℃，保持5 min。

质谱条件：离子源温度230 ℃，接口温度230 ℃；质量扫描范围35～450 m/z；质谱库NIST 11。检测出的物质通过计算机检索与Library-Mainlib 标准谱库对比，仅统计正反匹配度均超过800 的挥发性风味物质，采用面积归一化法进行定量分析。

1.3 数据处理

本实验数据分析采用WPS 2021 和Design Expert.V8.0.6软件进行数据分析处理。

2 结果与分析

2.1 发酵工艺单因素试验结果

2.1.1 不同菌种及接种量对蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响

实验选用3 种酿酒酵母，分别是DBS、AQ、LMD，对酒精度和感官评分的影响如图1 所示。LMD 发酵得到的蜂蜜酒无论是酒精度还是感官评分都高于另外两组，选用LMD 酿酒酵母作为发酵菌种。不同接种量对蜂蜜酒的酒精度和感官评分的影响如图2 所示，酒精度和感官评分随接种量的增加呈现增加的趋势，接种量2 g/L时最大。

图1 不同酵母菌种对蜂蜜酒酒精度和感官评分的影响

图2 不同酵母接种量对蜂蜜酒酒精度和感官评分的影响

2.1.2 不同氮源及添加量对蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响

实验选用(NH4)2SO4、(NH4)2HPO4和VB1作为氮源，研究不同氮源及添加量对酒精度和感官评分的影响，实验结果如图3 和图4 所示。3 种氮源的添加对酒精度无显著影响，添加(NH4)2HPO4作为氮源蜂蜜酒的感官评分最高，添加VB1作为氮源得到的蜂蜜酒出现异味，影响感官体验。

图3 不同氮源对蜂蜜酒酒精度和感官评分的影响

图4 不同氮源添加量对蜂蜜酒酒精度和感官评分的影响

2.1.3 不同初始糖度对蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响

不同初始糖度对蜂蜜酒酒精度的提升至关重要，初始糖度低无法提供足够的碳源用于发酵产生酒精，过高的初始糖度会产生过高的渗透压不利于酵母繁殖增长。不同初始糖度对蜂蜜酒的酒精度和感官评价的影响如图5 所示，酒精度随初始糖度的升高呈现先上升后下降的趋势，初始糖度的增加，致使渗透压增加，限制了酵母的繁殖和产酒精的能力[20]。初始糖度的增加有利于蜂蜜酒的口感提升，增加蜂蜜酒的柔和感。

图5 不同初始糖度对蜂蜜酒酒精度和感官评分的影响

2.1.4 不同pH 值对蜂蜜酒酒精度与感官评价的影响

原蜂蜜稀释液pH 值为7.0，使用柠檬酸调节蜂蜜稀释液pH值至3.0、4.0、5.0、6.0，再发酵得到蜂蜜酒，结果如图6 所示。蜂蜜稀释液的pH 值显著影响蜂蜜酒的感官评分，蜂蜜稀释液pH 值3.0 时得到的蜂蜜酒的酒精度和感官评分最低，未调节pH 值的蜂蜜稀释液发酵得到的蜂蜜酒酒精度和感官评分最高。

图6 不同初始pH值对蜂蜜酒酒精度和感官评分的影响

2.2 发酵工艺响应面优化试验结果

2.2.1 响应面试验结果与方差分析

在单因素实验的基础上，酵母的接种量、氮源的添加量及初始糖度对蜂蜜酒的酒精度和感官评分有较大影响，选择三者作为三因素，采用响应面法进行优化，筛选出纯蜂蜜发酵酒的最佳发酵工艺条件，响应面试验设计及结果见表3，方差分析结果见表4和表5。

表3 蜂蜜酒的响应面试验设计和结果

表4 蜂蜜酒酒精度的回归模型分析

表5 蜂蜜酒感官评分的回归模型分析

模型的二次多项式回归方程：

根据表4 可知，该模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明该模型误差较小，拟合度好。A2、B2、C2对酒精度影响极显著（P＜0.01），B 对酒精度影响显著（P＜0.05），模型相关系数R2=0.9736，表明该回归方程与试验结果具有较好的拟合度，可以用该方程表达酒精度与酵母接种量、氮源添加量和初始糖度之间的关系[21]。

模型的二次多项式回归方程：

根据表5 可知，该模型极显著（P＜0.01），失拟项不显著（P＞0.05），表明该模型误差较小，拟合度好。A、B、C、AB、A2、B2、C2对感官评分的影响极其显著（P＜0.01），BC 对感官评分影响显著（P＜0.05），模型相关系数R2=0.9904，表明该回归方程与试验结果具有较好的拟合度，可以用该方程表达感官评分与酵母接种量、氮源添加量和初始糖度之间的关系。

2.2.2 响应面交互影响

各因素交互作用对酒精度的影响如图7，当酵母接种量（A）、氮源添加量（B）和初始糖度（C）两两交互作用时，对蜂蜜酒酒精度均有影响，但影响程度存在一定差异。酵母接种量（A）和氮源添加量（B）的响应面较为平缓，等高线也显示酒精度变化跨度小，说明酵母接种量（A）和氮源添加量（B）对酒精度的影响小于初始糖度（C），在试验范围内可以获得酒精度为最大值的点。

图7 各因素交互作用对蜂蜜酒酒精度的影响响应面

各因素交互作用对感官评分的影响如图8，当酵母接种量（A）、氮源添加量（B）和初始糖度（C）两两交互作用时，对蜂蜜酒感官评分均有影响，AB、AC、BC 面分别随A、B、C 的增加，呈现先增加后下降的趋势，因此试验可以获得感官评分最大值的点[19]。

图8 各因素交互作用对蜂蜜酒感官评分的影响响应面

由Design expert.V8.0.6 预测得到，最佳工艺是：酵母接种量2.14 g/L，氮源添加量0.53 g/L，初始糖度28.01ºBx，此时模型预测值酒精度和感官评分分别为15.09 %vol 和86.4 分。为此设计试验进行验证，得到的蜂蜜酒酒精度为15.20 %vol，感官评分为86.5 分，与预测值相差不大，表明本工艺可行，纯蜂蜜酿酒能够达到这一酒精度尚数少见。

2.3 理化指标检测的结果

检测优化工艺后酿造得到的蜂蜜酒理化指标，见表6。酒精度、总酸、挥发性酸均符合QB/T 5475—2020《蜂蜜酒》标准[17]，但此标准中对蜂蜜酒的总糖规范不够明确，普遍认为可参照葡萄酒[22]和其他果酒的标准[23]，根据含糖量高低分为干型（总糖≤4.0g/L）、半干型（总糖4.1～12.0 g/L）、半甜型（总糖12.1～45.0 g/L）、甜型（总糖≥45.1 g/L）蜂蜜酒[24-26]。此外，蜂蜜酒中甲醇、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌未检出。

表6 蜂蜜酒理化和卫生指标检测结果

2.4 风味物质分析结果

本工艺酿造得到的蜂蜜酒检测出的风味物质组分及相对含量如表7 所示。检测出14 种挥发性风味物质，其中醛类和酯类相对含量最高，无不良风味物质出现，与感官评价结果一致。徐丽萍等[28]采用电子鼻和气相色谱-离子迁移谱法对蜂蜜酒发酵前后挥发性风味成分的迁移变化进行比较分析，发现发酵后的蜂蜜酒在保留蜂蜜原有风味的同时，新的风味成分显著增加，从而形成蜂蜜酒独特的风味特征。

表7 蜂蜜酒风味物质组分及相对含量

3 结论

本研究采用深棕色枣花蜜酿造蜂蜜酒，有研究表明深色蜂蜜的抗氧化活性显著高于浅色的蜂蜜，酿成蜂蜜酒仍然如此[29]。通过单因素及响应面试验得到纯蜂蜜酿酒的最佳发酵条件为菌种选用LMD酿酒酵母，酵母接种量2.14 g/L，氮源选择(NH4)2HPO4，氮源添加量0.53 g/L，初始糖度28.01ºBx，此条件下得到的蜂蜜酒感官评分86.5 分、总糖24.4 g/L、酒精度15.20 %vol、总酸3.6 g/L、挥发酸0.54 g/L，甲醇、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均未检出，检测出14 种挥发性风味物质。纯蜂蜜酿造酒酒体协调，呈透明琥珀色，无明显沉淀，无明显酸涩味，蜜香酒香浓郁和谐。本研究将蜂蜜酒酒精度提高至15.20%vol，风味也得到显著提升。此外，蜂蜜酒仍值得深入研究，如蜂蜜酒的特征风味以及风味和化学物质之间的联系还不清楚[30]，本地坊间还传言蜂蜜酒具有诸多功能性，滋阴补肾、延缓衰老等，赵彤等[31]也提出发酵蜂产品的功能性和作用机制值得深入研究。