预处理对山楂酒香气成分和抗氧化性的影响分析

蒋文鸿，王润峥，王 勇，刘素稳*，常学东

（1.中粮长城葡萄酒（宁夏）有限公司，宁夏银川 750000；2.河北科技师范学院食品科技学院，河北秦皇岛 066604）

果酒是以植物的果实作为原料，经发酵酿造而成的低酒精度饮料。随着近年来人民生活水平的逐步提高和消费品味的丰富多样化，营养丰富和口感柔和的果酒受到越来越多消费者的喜爱，逐渐成为人们居家旅行和宴会接待的必备饮品。

山楂（Crataegus pinnatifidaBunge），又名山里果、山里红，蔷薇科落叶小乔木植物山里红的果实[1]，果实外观呈球形，成熟后为深红色，表面呈现淡色小斑点。果实酸甜可口，含丰富的维生素、山楂酸、柠檬酸、黄酮类等，具有生津止渴的良好效果，也可入药使用，入药归脾、胃、肝经，有消食化积、降血压、活血散瘀的良好功效[2-3]。将其开发成具有高附加值的山楂酒，不仅可保留山楂的大部分营养成分，还能提升产品的附加值，促进山楂产业的发展[4]，并且符合粮食酒向果酒转变的国家酒类行业政策。以鲜山楂为主要原料酿制的山楂酒，是除猕猴桃酒外拥有行业标准的果酒[5]，符合消费者追求纯天然无污染、含糖量少、酒精度低且有益于健康的果酒消费潮流。

山楂酒是以新鲜山楂为原料，经清洗、破碎、发酵、稳定等工艺精心酿制而成的，酒质温和爽口，果香味浓，较好保留了山楂鲜果中的天然营养成分和总酚、黄酮等保健成分，是一种天然健康的生物饮品。色香味是消费者对食品的基本需求，香气成分也是果酒中十分重要的质量指标，香气和其他特性决定果酒的档次和品味[6]。山楂酒发酵过程中其香气成分和酚类物质会发生变化，为了更多保留有益成分，对山楂酒进行预处理可以保留更多的香气成分和抗氧化物质，增加山楂酒的香气并增强其抗氧化性，提高山楂酒的品质。本文通过GC-MS 和SPME 技术对预处理后山楂酒的香气成分进行分析，对比空白对照、水浴、微波等3 种不同处理的山楂在发酵后香气成分和抗氧化性的变化趋势，从而进一步研究预处理对山楂酒香气成分和抗氧化性的影响，为酿造高品质山楂酒提供参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

原材料：紫肉山楂，采摘于2021 年兴隆县；果胶酶，美国Sigma 公司；白砂糖，超市；干酵母，超市；没食子酸，原花青素，香草醛；碳酸钠、乙醇、硝酸铝、氢氧化钠、甲醇、盐酸、氯化钾、过硫酸钾，均为分析纯。

仪器设备：7890-5975 气相色谱-质谱联用仪，美国Agilent 公司；实验室pH 计(FE20)，梅特勒-托利多仪器有限公司；微波炉，LG 烧烤型微波炉WD800（MG-5530S），乐金电子电器有限公司；显数恒温水浴锅(HH-4)，金坛市杰瑞尔电器有限公司；低速离心机(TDZ5-WS)，长沙湘仪离心机仪器有限公司；紫外分光光度(U2910)，双光束紫外分光光度计；鼓风干燥箱(DHG-9245A 型)，上海慧泰仪器制造有限公司；电子分析天平(AL104)，梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 山楂酒样品预处理

挑选无破损、病虫害、霉变，颗粒饱满的山楂，去核，去梗，做前期处理，每个处理选取1 kg山楂。

（1）对照组：每50 g 破碎的山楂中加入75 mL水，不做其他处理。

（2）水浴组：每50 g 破碎的山楂中加入75 mL水，在50 ℃的水浴中水浴1 h。

（3）微波组：每50 g 破碎的山楂中加入75 mL水，在540 W微波下处理50 s。

1.2.2 山楂酒酿造工艺流程

山楂→分选→洗涤→破碎→预处理→山楂汁的制备→添加果胶酶→加糖、酵母→发酵→分离→后发酵→补加SO2→贮存→下胶→过滤→冷冻→过滤→装瓶→成品

1.2.3 发酵过程

采用1∶2 的山楂酒料水比进行料液添加，再加入75 mg/L 的二氧化硫并在25 ℃的培养箱中放置24 h。为使山楂汁中有效物质充分溶解，还要加入110 mg/L 的果胶酶，在37 ℃下放置6 h。果胶酶处理结束后，及时加入白砂糖以补充糖分。随后加入活化酵母，二次加糖，将调好的山楂汁在25 ℃培养箱中放置发酵。每天搅拌一次，测酒精度，第12 d发酵结束。

1.2.4 检测指标与方法

1.2.4.1 固相萃取仪萃取香气

将100 μm PDMS 萃取头在气相色谱进样口老化2 h，老化温度250 ℃。选取不同山楂酒样品置于15 mL 顶空瓶中，上部留有2 cm 左右的空间，封口。将老化后的萃取头插入样品瓶顶空部分，于45 ℃吸附40 min，将吸附后的萃取头取出后插入气相色谱进样口，于250 ℃解吸3 min，用气相色谱-质谱联用仪进行测定分析。

1.2.4.2 山楂酒香气的GC-MS分析

色谱柱：30 m×0.25 mm×0.25 μm DB—225MS甲基硅氧环毛细管柱；GC/MS 条件：升温程序为40 ℃保持2 min，以5 ℃/min 升温至100 ℃，再以5 ℃/min 升温至220 ℃；载气：氦气，流量：1.0 mL/min；进样口温度250 ℃，检测器温度230 ℃。

质谱条件：EI 源，离子源温度230 ℃，电离方式为电子轰击（Electron Impact，EI），电子能量70 eV，扫描质量范围：10～425 amu[7]。

1.2.4.3 总酚测定

取酿造好的山楂酒，离心机4000 r/min 离心10 min，取上清液备用。

采用福林酚法[8]，精密称取没食子酸0.1 g 定容至100 mL容量瓶中，制成1 mg/mL的没食子酸标准溶液。分别准确量取上述标准液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL 于100 mL 容量瓶中定容，取1 mL 上述标准溶液，加5 mL 经稀释10 倍的福林肖卡试剂，摇匀。1 min 之后加入7.5%碳酸钠溶液4 mL，充分混匀，蒸馏水定容至10 mL，在75 ℃下反应10 min，于765 nm 波长比色，测定吸光度，绘制标准曲线(y=0.6513x+0.0913，R2=0.9992)。

按照标准曲线方法取山楂酒，测定吸光度，根据标准曲线计算总酚的含量（以每100 mL 酒中所含没食子酸mg数表示）。

1.2.4.4 花色苷测定

采用pH 示差法[9]，制备pH1.0 和pH4.5 的缓冲溶液。

取测总酚处理好的山楂酒1 mL，分别用pH1.0和pH4.5的缓冲溶液定容至10 mL，分别在520 nm、700 nm 处测其吸光度，每个样品重复测定3 次，取平均值。

式 中：A=（A520 nm-A700 nm）pH1.0-（A520 nm-A700 nm）pH4.5；MW 为矢车菊-3-葡萄糖苷的分子质量449.2；DF 为稀释倍数10；B 为矢车菊-3-葡萄糖苷的消光系数26900；L为比色皿光程（1 cm）。

1.2.4.5 抗氧化性测定

（1）DPPH：取1 mL 山楂酒与3 mL DPPH 溶液充分摇匀避光，37 ℃水浴30 min 后在517 nm 处测定其吸光值，同时以蒸馏水代替样品做空白对照实验，以样品和无水乙醇混合液作为样品调零，以蒸馏水和无水乙醇混合液作为空白对照调零。

（2）ABTS：取1 mL 山楂酒液与3 mL ABTS 工作液，混合10 s 后在暗处准确反应6 min，在734 nm波长下测定吸光度。同时以蒸馏水代替样品做空白对照实验，以样品和蒸馏水混合液作为样品调零，以4 mL的蒸馏水为空白作为空白对照调零[10]。

（3）总抗氧化能力的测定（T-AOC）：利用总抗氧化能力测定试剂盒测定，将酿造好的山楂酒，用离心机4000 r/min离心10 min，取上清液，作为待测样品，按照样品与双蒸水1∶9 处理，按照试剂盒说明书操作。

单位定义及计算公式：

1.2.5 统计分析

文中实验数据为三次试验数据的平均值；使用DPS统计分析软件进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 山楂酒香气成分的GC-MS总体检测结果

表1 为香气成分的GC-MS 分析结果。成分鉴定根据质谱图经计算机检索同时与NIST11.L 质谱库相对比，并结合人工图谱解析及资料分析，确认挥发性物质的各化学成分，按峰面积归一化法求得各组分相对质量百分含量[11]。

表1 山楂酒香气成分的GC-MS检测结果

酒体香气成分主要由酯类、醇类、酸类、醛类等化合物构成，这些不仅是酒体质量的重要组成部分，还对酒的感官特征有重要影响[12]。本实验共鉴定出77种芳香成分，用SPME技术萃取果酒香气和GC-MS 技术可检测鉴定山楂酒预处理后88 %以上的香气成分，主要香气种类及含量见表1。山楂酒的香气成分中醇类物质相对含量最高。对照组山楂酒鉴定到的香气有57 种，其中醇类物质18 种，相对含量为50.14 %；酯类物质16 种，相对含量为32.24 %；酸类物质11 种，相对含量为6.95 %；醛类物质6 种，相对含量为1.81 %；酚类物质2 种，相对含量为2.65 %；其他物质4 种，相对含量为0.91%。水浴组山楂酒鉴定到的香气只有51种，其中醇类物质17 种，相对含量为56.87 %；酯类物质16 种，相对含量为16.69 %；酸类物质7 种，相对含量为9.42 %；醛类物质7 种，相对含量为2.26%；酚类物质3 种，相对含量为3.2%；其他物质1 种，相对含量为0.58 %。微波组山楂酒鉴定到的香气为55种，其中醇类物质17 种，相对含量为55.22%；酯类物质15 种，相对含量为18.3%；酸类物质9 种，相对含量为9.09%；醛类物质8 种，相对含量为1.15%；酚类物质2 种，相对含量为4.3%；其他物质4 种，相对含量为0.64%。

2.2 醇类组分比较分析

山楂酒中的主要香气成分是醇类物质，是酵母细胞分解氨基酸或糖类物质产生的次级产物，在果酒香气中起到十分重要的作用[13]。由表2 可知，上述3 种方法中，醇类物质含量最高，其中对照组的醇类相对含量为50.14 %，水浴组醇类相对含量为56.87%，微波组醇类相对含量为55.22%。

表2 三组山楂酒中香气组成及含量

2.3 酯类组分比较分析

酯类化合物是构成酒体果香和酒香的重要物质，主要有3 种来源：一是存在于水果原料中构成果香的酯；二是在发酵过程中酵母菌细菌活动形成的酯；三是来源于贮存过程中的酯化反应[14]。本实验在山楂酒挥发性物质中对照组检出16 种，水浴组检出16 种，微波组检出15 种。对照组山楂酒中乙酸异戊酯15.22 %，辛酸乙酯8.49 %，己酸乙酯2.23 %；水浴组山楂酒中辛酸乙酯9.36 %，己酸乙酯3.57 %；微波组山楂酒中辛酸乙酯8.39 %，己酸乙酯2.66%，乙酸己酯2.39%等。各酯类含量相差不大，但对果酒的香味具有十分重要的影响。

2.4 酸类组分比较分析

适量的有机酸使果酒口感清爽，若缺乏酸类，果酒就会显得黏稠，而过量的酸会使口感粗糙、不柔和、不协调，合适的糖酸比对酒体平衡以及滋味起着重要作用。有机酸能抑制大部分引起果酒腐败变质的有害微生物的繁殖[15]。表2 显示，本实验在山楂酒挥发性物质中对照组检出11 种，水浴组检出7 种，微波组检出9 种。对照组山楂酒中辛酸3.56 %，3-乙烯乙酸1.71 %；水浴组山楂酒中3-乙烯乙酸4.55 %，辛酸3.77 %；微波组山楂酒中辛酸3.53%，4-乙烯乙酸3.45%。

2.5 其他种类组分比较分析

山楂酒中的挥发性成分除去已经检出的醇类化合物、酯类化合物和酸类化合物外，还检测出少量醛类物质、酚类物质以及其他种类香气成分，如1-Octanal 辛醛、Asparagine 天冬酰胺等。这些物质含量较低，阈值相对较低，但对山楂酒的独特香气具有十分重要的影响[16]。

2.6 预处理对总酚和花色苷含量的影响

经过不同处理后的山楂酒中总酚含量如图1所示。从图1 可看出，与未处理的山楂酒相比，不同处理方法对山楂酒中总酚含量均有显著的影响(P＜0.05)。酚类物质也会影响木瓜酒的品质，改变其口感、风味、色泽等[17]。由于山楂酒中酚类化合物的存在，使山楂酒具有抗氧化性，这些物质含量的多少直接影响山楂酒抗氧化性的强弱。在发酵过程中，总酚和黄酮的含量先上升后下降，是因为酵母所产生的次级代谢产物与酒中的总酚和黄酮物质发生反应[18]；酚类物质被微生物产生的酶降解而沉淀，也导致其含量的减少。由图1 可知，发酵结束后，对照组中总酚含量为234.92 mg/100 mL，水浴组中总酚含量为297.44 mg/100 mL，微波组中总酚含量为214.40 mg/100 mL。相比之下，经水浴处理的山楂酒中总酚含量相对较高。

图1 山楂酒发酵及贮藏期间酚类物质变化

山楂酒经过不同处理后的花色苷含量如图1所示。从图1 可以看出，山楂酒中花色苷含量变化趋势与总酚变化规律一致，与未处理的山楂酒相比，不同处理方式对其花色苷含量均有显著的影响(P＜0.05)[19]。花色苷为水溶性物质，更易被山楂酒中的酒精溶解，在发酵过程中，山楂果实中的花色苷转移到发酵液中，使得山楂酒中花色苷的含量急剧上升，达到最高花色苷含量。花色苷易受到光、pH 值、温度等影响分解，所以，花色苷的含量在发酵结束后有所减少。由图1 可知，当发酵结束后，对照组中花色苷含量为5.71 mg/L，水浴组中花色苷含量为7.03 mg/L，微波组中花色苷含量为5.81 mg/L。相比之下，经水浴处理的山楂酒中花色苷含量相对较高。

2.7 不同预处理对山楂酒抗氧化性的影响

2.7.1 自由基清除率的比较

经过不同预处理的山楂酒DPPH 自由基清除活性结果及ABTS自由基的清除能力如图2所示。

图2 不同处理方式后山楂酒DPPH法、ABTS法自由基清除率

从图2 可以看出，未处理山楂酒及不同预处理后山楂酒对DPPH 自由基均具有很好的清除活性，不同处理方式也均具有很好的ABTS 自由基清除能力。Hanula 等[20]的研究结果表明，微波技术的应用缩短了时间，保证了总酚类化合物的高含量和强的抗氧化活性。发酵结束时，三组DPPH 法自由基清除率均为84 %，利用ABTS 法得出自由基清除率，对照组和微波组组均为69 %，水浴组为70 %，利用T-AOC 法得出总抗氧化能力对照组为146 unit/mg，微波组为153 unit/mg，水浴组161 unit/mg；当发酵结束后贮藏4 个月时，利用DPPH 法得出自由基清除率，对照组为69 %，水浴和微波组均为79%，利用ABTS 法得出自由基清除率，对照组和微波组组均为75 %，水浴组为77 %，利用T-AOC 法得出总抗氧化能力为对照组142 unit/mg，微波组134 unit/mg，水浴组148 unit/mg。根据以上数据可知，经水浴处理的山楂酿造的山楂酒对自由基具有较好的清除能力，微波以及未处理的山楂酒对自由基的清除能力较弱。

2.7.2 总抗氧化能力分析

由图3 可知，不同预处理后的山楂酒在发酵及贮藏期间的抗氧化能力存在明显差异。水浴组山楂酒的抗氧化能力整体强于微波组和对照组山楂酒的抗氧化能力，具有较强的抗氧化性。这是由于水浴处理的山楂，经发酵酿造而成的山楂酒中总酚和花色苷的含量相对较高。总酚和花色苷是山楂酒中主要的抗氧化物质，山楂酒中抗氧化物质的含量较高，对氧自由基的清除能力有所加强，氧自由基的清除率也相对较高，与2.7.1 中结论一致。所以，水浴组山楂酒的抗氧化能性相对最强。

图3 山楂酒发酵及贮藏期间总抗氧化能力变化

利用T-AOC 法测定三组山楂酒发酵及贮藏期间的抗氧化能力，并对山楂酒的抗氧化能力与其总酚含量的相关性进行分析。从图4 可以看出，对照组山楂酒的抗氧化能力与其总酚含量(r=0.835，P＜0.05)，水浴组山楂酒的抗氧化能力与其总酚含量(r=0.947，P＜0.01)和微波组山楂酒的抗氧化能力与其总酚含量(r=0.781，P＜0.05)均具有显著相关性，说明山楂酒中的总酚是其发挥抗氧化性的主要活性物质。Wojdylo 等[21]研究发现，微波和水浴处理的葡萄酒多酚含量整体高于对照组，具有更强的抗氧化能力。

图4 山楂酒中总酚含量与抗氧化能力之间关系

3 结论

不同方法对山楂进行预处理，GC-MS 检测到的香气成分种类和相对含量均不同，预处理后部分香气种类减少，但主要呈香物质得以保留。山楂酒的主要呈香物质为醇类，且经水浴处理后的山楂酒中醇类物质最多，香味最浓。在相同发酵情况下，水浴处理的山楂酒总酚含量较高，具有较强的抗氧化性。经水浴处理的山楂酒在4 个月贮藏期间酚类物质变化较小，抗氧化性相对较好。因此，经过水浴处理的山楂酒比对照、微波处理的山楂酒品质更高，后期需进一步研究其营养成分的变化规律，以综合评判预处理在果酒中的适用性。