中国白酒中健康因子四甲基吡嗪的研究进展

龙亚飞，赵益梅，冉光耀，胡智慧，张春林，吴德光

（茅台学院酿酒工程系，贵州仁怀 564500）

中国白酒历史悠久，它是以粮谷为主要原料，采用大曲、小曲或麸曲为糖化发酵剂，经过蒸煮、糖化、发酵、蒸馏而制成的蒸馏酒[1-2]。近年来，由于人们生活水平的提高，越来越多的人关注保健、养生，“健康饮酒”是中国白酒研究的热点问题，研究人员将中国白酒中含有的对人体健康有利的成分统称为健康功能因子，简称健康因子[3]。四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine,TTMP）又名川芎嗪[4]，是我国首先从常用中药川芎中提取出的生物碱，是川芎治疗心脑血管疾病的有效成分之一，临床上已广泛应用于治疗缺血性心脑血管疾病及慢性心衰、肾衰等并且取得了良好的疗效。吴建峰[5]在2006 年率先提出四甲基吡嗪是白酒中的主要功能性成分之一，在不同香型白酒中普遍存在，引起行业的关注。

在所有蒸馏酒中，四甲基吡嗪是中国白酒特有的功能性成分，四甲基吡嗪赋予了中国白酒有益健康的功能，对酒体贡献甜香、坚果香及花香，能对其他香味物质起到明显的烘托叠加作用，丰满白酒香气[6-7]。本文就中国白酒中四甲基吡嗪研究现状进行总结，以期为科学研究中国白酒中的四甲基吡嗪提供参考。

1 四甲基吡嗪类的性质与功能

吡嗪是一类含有2 个对称氮原子的六元杂环化合物（图1），在自然界中广泛存在，烷基吡嗪是一类在碳原子上只发生碳氢取代的化合物，其中R1、R2、R3、R4 被甲基取代即为四甲基吡嗪（图2），是一类重要的烷基化吡嗪，白色针状晶体，具有令人愉快的、特殊的烤肉和炒坚果香气。四甲基吡嗪还是国际公认的、安全的食品风味添加剂[8]。在医学界，四甲基吡嗪是中草药川芎根茎的主要生物活性成分，具有抑制血小板聚集、扩展血管和防止血栓形成等作用[9]，对治疗呼吸系统疾病、肾小球疾病、心脑血管疾病等也有一定的疗效[10-11]，还可以用于食疗，有利于增强认知能力[12]。此外，四甲基吡嗪治疗老年慢性肺心病患者动脉高压时可以发生低血压反应，四甲基吡嗪作为中药单体，有降低低氧PAH 的作用，且不影响动脉血压，已被《中国药典》收录[13]。

图1 吡嗪的化学式

2 中国白酒中四甲基吡嗪的形成途径

四甲基吡嗪作为一种健康的风味化合物，国外研究者对不同产品中四甲基吡嗪的来源也进行过研究，某些烘焙食品中的四甲基吡嗪主要来自美拉德反应，但其他一些产品则主要来自微生物代谢作用。

2.1 美拉德反应

食品烘焙过程中羰基化合物（还原糖类）和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）会发生非酶促的美拉德反应[14]，对食品风味、颜色的形成有十分重要的作用。人们普遍认为美拉德反应是非酶促的化学反应，反应条件一般是温度大于100 ℃，pH≥7，含水量不超过25 %，这一反应条件在中国白酒中很难达到，庄名扬等[15]通过实验，认为大曲中地衣芽孢杆菌某种酶系可以催化美拉德反应发生，其中产物含四甲基吡嗪。2005 年庄名扬[16]再次提出，中国白酒的香和味部分由美拉德反应产生。2019 年，ZHANG 等[17]研究芝麻香型白酒中四甲基吡嗪变化时，提出中国白酒中四甲基吡嗪形成主要存在于温度较高的制曲、高温堆积、蒸馏等阶段。截至目前，研究发现，关于吡嗪类化合物的产生途径已经非常清楚，微生物的作用占70%以上，而美拉德反应的作用约30%不到。

2.2 微生物代谢作用

1962 年，Kosuge 等[18]在日本的发酵豆制品“纳豆”中分离得到四甲基吡嗪，并首次发现是其中的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）通过生物合成获得四甲基吡嗪。1967 年，Demain 等[19]发现一株突变的谷氨酸棒状杆菌利用异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸和泛酸，通过变异的异亮氨酸缬氨酸途径，合成四甲基吡嗪，提出枯草杆菌培养体系中四甲基吡嗪的生物合成途径——由糖的代谢产物3-羟基丁酮和氨基酸的氨基部分生物合成，这是最早关于微生物合成四甲基吡嗪机制的报道。直到2011 年，江南大学徐岩[20-23]团队研究发现白酒中四甲基吡嗪并非完全来源美拉德反应，而是来源于微生物的代谢反应，其产生机制为：功能菌株糖降解产生丙酮酸，两分子的丙酮酸缩合生成α-乙酰乳酸，α-乙酰乳酸脱酸产生乙偶姻，发酵体系中的乙偶姻和主要由氨基酸转化而来的氨通过非酶促反应生成四甲基吡嗪。研究发现，在中国白酒中产吡嗪的微生物主要是芽孢杆菌，以枯草芽孢杆菌最多。

3 中国白酒中四甲基吡嗪的分析检测技术

关于药品中四甲基吡嗪检测方法，在《中国药典》中已建立了高效液相色谱（High performance liquid chromatography，HPLC）的检测方法体系[24]。食品添加剂中四甲基吡嗪的检测分析，香气的评定是按照GB/T 14454.2 执行，分析检测是按照GB/T 11539—1989 中第5 章的规定，即填充柱气相色谱分析[25]。由于中国白酒中四甲基吡嗪含量低（浓度为ppb 级），所以白酒中四甲基吡嗪前处理尤为重要，目前常用的前处理方法主要有液液萃取法和顶空固相微萃取法，经过前处理后的白酒，一般用高效液相色谱和气相色谱进行检测。

对白酒中四甲基吡嗪的分析检测，一开始主要进行定性分析，随着检测技术发展，对白酒中四甲基吡嗪进行定量分析，后来在检测的准确度、灵敏性、快速性上进行深入研究，除了常规的高效液相色谱和气相色谱检测外，还创建了新的检测方法，具体研究如下：范文来等[26]应用液液萃取和分馏技术研究了绵柔型洋河蓝色经典酒微量挥发性成分，经气相色谱质谱仪（Gas chromatograph mass spectrometer，GC-MS）检测，检测到四甲基吡嗪；王晓欣等[27]采用液液萃取法对酱香白酒中的香气化合物进行浓缩，并通过气相色谱-闻香法（Gas chromatography-Odor，GC-O）结合气相色-质谱（GCMS）分别进行香气成分分析，其中四甲基吡嗪香气描述为焙烤香，平均香气强度为3.5；孙啸涛等[28]采用涡旋辅助液液萃取结合气相色谱-质谱（GCMS）对67 种白酒中四甲基吡嗪进行检测，分析表明，67 种白酒均含有四甲基吡嗪，含量范围为1.5～2434.3 μg/L；杨帆等[29]在分析茅台大曲中3 株芽孢杆菌代谢产物时，采用液液萃取结合GC-MS 分析检测，发现地衣芽孢杆菌MTDB-01 和枯草芽孢杆菌MTDB-03 代谢产物中有四甲基吡嗪；王莉等[30]利用气相色谱-质谱-离子扫描联用（GC/MS-SIM）技术，直接定量分析了7 种样品酒的四甲基吡嗪含量，该方法具有准确度高、灵敏度高、检测时间短等特点；张温清等[31]建立了用气相色谱内标法测定芝麻香型白酒中四甲基吡嗪含量的方法，该方法具有操作简便、精密度好、准确度高的特点，酒中四甲基吡嗪含量为1.20 mg/L；高传强[32]采用顶空-固相微萃取法（Headspace-solid phase microextraction method，HS-SPME）与气相色谱-质谱联用法分析芝麻香型白酒风味物质，发现四甲基吡嗪的含量很高，含量为1.27 mg/L。吴婷婷等[33]对梅兰春芝麻香酒的健康成分分析，采用顶空固相微萃取和气相质谱联用法检测到梅兰春酒样（1 号和2 号）中四甲基吡嗪的平均含量为0.71 mg/L；孙棣等[34]建立了液相色谱-串联质谱检测法对8 种吡嗪化合物进行定量分析，发现真茅台酒四甲基吡嗪的含量在9.25～28.3 mg/L，假茅台酒中四甲基吡嗪的含量在0.89～12.5 mg/L，该方法灵敏度高、专属性好，样品直接进样，在检测方法上进行了创新；韩兴林等[35]采用GC-FID（氢火焰离子化检测器）结合GC-MS分析云门酱香型白酒风味特征成分，发现云门酱香白酒中四甲基吡嗪的含量偏低，其中南方的飞天茅台四甲基吡嗪含量为6.52 mg/L，云门酱香的含量为0.43 mg/L；徐占成等[36]采用全二维-飞行气质联用检测仪（GC-GC-TOFMS）及HPLC-MS 对剑南春酒中微量香味物质进行分析检测，定性检测了四甲基吡嗪；任学坤等[37]设计出一种利用气相色谱外标法测定白酒中四甲基吡嗪的方法，并对含量进行测定；司冠儒等[38]首次利用高效液相色谱技术建立了一种芝麻香型白酒中健康功能因子四甲基吡嗪的快速检测方法，测得宣酒芝麻香白酒中四甲基吡嗪含量分别为1.26 mg/L、1.02 mg/L、1.31 mg/L；王国明等[39]应用液液萃取结合气相色谱-质谱联用对浓香型山庄老酒吡嗪类物质进行分析，检测发现四甲基吡嗪的含量高于100 μg/L；司冠儒等[40]建立了气相色谱内标法、液相色谱外标法和液相色谱质谱联用外标法测定芝麻香白酒中的四甲基吡嗪，对检测四甲基吡嗪的回收率和精密度进行了比较，发现液相色谱质谱法测定白酒中四甲基吡嗪效果最好；梅明明等[41]采用直接进样法和液液萃取浓缩法进样样品前处理，建立了GC-MS 测定白酒中常见吡嗪类化合物的方法，对酱香型和浓香型白酒中四甲基吡嗪含量进行测量，分别为17.03 μg/L和0.53 μg/L；黄杰等[42]建立了白酒中四甲基吡嗪的气相色谱-三重四级杆质谱（GC-QQQ）测定法，首次开发了一种利用三重四级杆气质联用仪测定白酒中四甲基吡嗪含量的方法，能够准确进行定性和定量，具有快速、准确、选择性好、灵敏度高等优点；史改玲等[43]应用液液萃取结合气相色谱-质谱-选择离子扫描（gas chromatography mass spectrometry-selective ion monitoring，GC-MS-SIM）技术检测20 种酒样中的四甲基吡嗪含量，发现四甲基吡嗪在酱香型酒样中质量浓度为2379.65～2985.09 μg/L，远高于芝麻香型酒样的1116.80～1309.66 μg/L 及浓香型酒样的245.40～555.76 μg/L，具有检测快速、准确度高、专一性强等优点；赵应梅等[44]建立了GC-MSSIM(选择离子扫描）快速检测四甲基吡嗪的分析方法，茅台、珍酒、郎酒中四甲基吡嗪的含量分别为9.42 mg/kg、3.31 mg/kg、1.40 mg/kg，该方法的特点是缩短了样品前处理时间，减少了目标物的损耗，能检出低浓度的吡嗪类化合物。

4 提高中国白酒中四甲基吡嗪含量研究

在明确中国白酒中四甲基吡嗪来源和机理及检测技术后，研究人员把目标锁定在如何提高中国白酒中四甲基吡嗪含量，梳理文献资料发现，主要通过筛选高产四甲基吡嗪的菌株，优化发酵条件，使其产四甲基吡嗪的含量达到最大，再将其应用到白酒的生产过程。具体研究如下：2022 年，范恩帝等[45]为提高酱香白酒中四甲基吡嗪含量，从酱香大曲中筛选出菌株西姆芽孢杆菌一株，应用于酱香大曲模拟生产时，发酵产物中四甲基吡嗪的产量可以达到65.51 mg/kg；2022 年，王庆等[46]从高温大曲中筛选高产四甲基吡嗪菌株，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，对其发酵条件优化后，四甲基吡嗪产量为728.38 mg/L，比优化前提高了167%；2022 年，郭春生等[47]以高温大曲为材料，筛选出一株高产四甲基吡嗪的菌株（1-13），鉴定为解淀粉芽孢杆菌，经发酵条件优化后四甲基吡嗪产量可达（166.19±2.79）mg/L，较优化前（112.26 mg/L）提高48 %；2022 年，张春林等[48]从高温大曲中筛选出4株产酱香风味的细菌，鉴定为枯草芽孢杆菌YHB0165、枯草芽孢杆菌YHB0169、巨大芽孢杆菌YHB0170 和枯草芽孢杆菌YHB0171，发酵产物中四甲基吡嗪含量分别为67.30 ng/g、17.80 ng/g、78.30 ng/g、69.86 ng/g；2022 年，梁慧珍等[49]从高温大曲中筛选出一株产吡嗪类的菌株，鉴定为芽孢杆菌（X1），用于强化大曲，对提高四甲基吡嗪有显著影响，比对照组提升2.36 倍；2022 年，张颖等[50]为提高白酒中四甲基吡嗪的含量，从高温大曲中筛选出一株高产四甲基吡嗪的功能菌，鉴定为地衣芽孢杆菌（GTBL-168），测得发酵液总四甲基吡嗪含量为12.22 mg/L；2021年，吴钱弟等[51]对芽孢杆菌与酵母菌和根霉曲混合发酵提高四甲基吡嗪含量进行研究，发现先接种酵母菌和根霉曲，再接种芽孢杆菌发酵，四甲基吡嗪含量最高，为881.5 μg/g；2021 年，张颖[52]筛选出产四甲基吡嗪的功能菌后，将功能菌制成麸曲,其TTMP 含量是传统大曲中的160 倍，协同传统大曲进行窖面酒发酵,较空白对照窖池，窖面基酒中TTMP含量提高了160.71%，用头尾酒浸泡麸曲后回地锅串蒸，窖面基酒中TTMP 含量提高了85.75%，将俩种方式结合应用于窖面酒的发酵，TTMP 含量提高了202.75 %，将实验窖与对照窖基酒进行品评，结果实验窖基酒在曲香特征和整体风格上均优于传统生产的基酒，但干净度比传统工艺基酒低；2020年，黄治国等[53]以高温大曲曲房空气中可培养细菌为研究对象，分离出3 株菌，在高粱汁液态发酵物中检测到四甲基吡嗪含量比较高；2020 年，卢君等[54]采用菌种强化结合工艺优化的方法，将酱香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量提高了202.75%，该研究提供了一种适合企业落地应用的进一步提高酱香型白酒基酒中四甲基吡嗪含量的方法；2020 年，钟桂芳等[55]以高温大曲为研究对象，筛选了两株高产四甲基吡嗪的菌株，鉴定为甲基营养型芽孢杆菌和蛋白水解型芽孢杆菌，可用于白酒工艺改进，提升原酒中四甲基吡嗪的含量；2020 年，周榆林等[56]通过加热强化工艺制成的高温大曲中四甲基吡嗪的含量由常规曲组未检出提升至0.13 mg/100 mL；2019 年，张温清等[57]从宣酒大曲中筛选出高产四甲基吡嗪的功能菌株，鉴定为解淀粉芽孢杆菌，固态发酵生产麸曲中四甲基吡嗪的含量最高，为202.54 mg/kg；2018 年，陈诗佳等[58]通过分子育种手段选育了高产乙偶姻酵母菌株，并应用到清香型麸曲白酒中，与出发菌株比较，该菌株发酵后酒醅中四甲基吡嗪含量提高了74.66 %。2018 年，葛向阳等[59]将筛选到的吡嗪类合成能力较强的菌株应用到大曲中，将大曲中四甲基吡嗪含量提高到100～380 mg/kg，较传统中高温曲提高了4～10 倍；2018年，马美荣等[60]将筛选的4 株高产四甲基吡嗪芽孢杆菌应到清香型原酒的生产中，极大提升了清香型原酒中四甲基吡嗪的含量，高达10 mg/L；2018 年，葛向阳等[61]使用强化高产四甲基吡嗪地衣芽孢杆菌的大曲发酵浓香型白酒，结果浓香型原酒中四甲基吡嗪含量提高到了3～6 mg/L，较传统浓香型白酒提高了5～20 倍；2017 年，王晓丹等[62]将筛选到的地衣芽孢杆菌用于提高碎沙酒酱香风格特征，将菌株添加到窖池中层的糟醅中，与空白糟醅做对比分析，发酵后糟醅中四甲基吡嗪含量达6.81 μg/g，是对照组的3.03 倍，酒样中四甲基吡嗪相对百分含量达0.028%；2016 年，李晓欢等[63]对从古井桃花曲中筛选到的高产四甲基吡嗪菌株进行优化，与初始条件下比，四甲基吡嗪含量达到833 mg/L，提高了46 倍；2016 年，李晓霞[64]从汾酒大曲中筛选到高产四甲基吡嗪菌株，并制备芽孢杆菌固体制剂应用于酿酒车间，酿造的汾酒保持了基本特性，经专业评酒师品评认为增加了绵甜感，四甲基吡嗪增加到5.3 μg/mL，比对照增加了近3倍。

5 总结与展望

葡萄酒中白芦藜醇的发现，促进了葡萄酒市场的快速发展，啤酒中支链寡糖、蛋白质、氨基酸、维生素及矿物质等丰富的营养物质，被誉为“液体面包”，极大促进了啤酒产业的发展。白酒中四甲基吡嗪的发现使人们认识到中国白酒中含有健康功能因子，对引领整个白酒界“健康白酒”的理念具有重要的意义。在保证白酒风味和口感协调的基础上，建议中国白酒中四甲基吡嗪的研究可以从以下几点入手：（1）利用代谢工程技术改造功能菌（主要是芽孢杆菌）从头合成四甲基吡嗪机制研究；（2）当前研究较多是筛选产四甲基吡嗪的细菌，可以把目标转移到筛选产四甲基吡嗪前体物质乙偶姻的微生物（例如酵母菌），并将不同菌株混合应用，找出最佳组合方式；（3）采用分子生物学技术，保证筛选出的产四甲基吡嗪功能菌株的稳定性；（4）外源添加产四甲基吡嗪药材，比如在白酒发酵原料中适量添加中药川芎粉末（或川芎的浓缩液）；（5）实践中可以通过调控发酵进程（温度、pH 值、含氮等）提高白酒酒体中四甲基吡嗪含量。总之，可以从多维度提高中国白酒中四甲基吡嗪的含量，达到适量饮用富含四甲基吡嗪白酒有益健康的目的，提升中国白酒相对于其他酒种在市场中的竞争力。