白酒中氨基甲酸乙酯形成途径及影响因素的研究进展

路 瑞，马 龙，唐 云，郇 丹，李永霞，赵亚雄

（金徽酒股份有限公司，甘肃陇南 742308）

作为世界六大蒸馏酒之一，中国白酒具有悠久历史和独特工艺，其在我国社交、庆典及其他传统活动中扮演重要角色，代表了我国丰富多样的酒文化。同时，在国际市场上中国白酒也具有一定的知名度和影响力。在白酒酿造过程中会自发产生一类可致癌的副产物，即氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）。目前为止，大量研究显示大部分发酵食品包括酒精饮料中都含有EC[1-3]，且有研究显示EC 具有多位点基因毒性，对人类具有潜在的致癌风险[1]。2007 年国际癌症研究署（International Agency For Research On Cancer，IARC）正式将EC归为2A 类致癌物质[3-4]。之后，许多国家开始关注酒精饮料中的EC 并对不同酒饮品中的最高EC 残留量进行了设定。其中，国际规定蒸馏酒中EC 最高限量为150 μg/L[5]。目前，我国尚未制定酒精饮料中EC限量标准。随着人们对EC的关注度增加，国内外科研人员对白酒酿造、蒸馏、贮存过程中EC的生成代谢，EC 检测方法优化以及EC 生物毒性进行了相关研究。鉴于我国尚未建立白酒中EC 限量标准，本文参考国内外相关研究内容，针对食品中EC 研究进展、白酒酿造过程中EC 代谢机制以及影响EC 形成因素等方面进行综述，以期为中国白酒产品安全风险评估、建立白酒中EC 限量标准以及白酒产业的可持续健康发展提供理论基础。

1 EC概述

19世纪初，在植物生长促进剂与抑制剂的研究过程中，研究人员发现EC具有抑制植物组织、细菌以及小鼠肿瘤细胞生长的功能[6]。随着研究的深入，EC 被用作人类和实验动物催眠及抗肿瘤的药物，直到1943 年首次在小鼠中发现其可引起肺腺瘤[7]。之后的动物研究表明，实验动物接触EC可增加机体多位点肿瘤发病率，包括肺、肝、淋巴、乳腺以及皮肤等器官[8]。EC 主要通过皮肤以及肠道上皮组织快速进入体内，虽然摄入机体中的EC 大部分被水解后排出体外，但少部分EC 在机体中经过细胞色素P450 氧化分解形成乙烯基-氨基-甲酸酯环氧化物，该物质能破坏脱氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）结构，也能造成Cu2+调控的DNA损伤，最终导致细胞癌变[9]。随着21 世纪分子生物学及细胞生物学等的快速发展，EC 致癌机制的相关研究更加深入。在啮齿动物的EC 毒性研究中发现，EC 在机体中被细胞色素P450 转化为N-羟基-氨基甲酸乙酯（0.1%）和氨基甲酸乙酯环氧化合物（0.5 %）。其中，N-羟基-氨基甲酸乙酯最终转化为以活性氧（Reactive oxygen species,ROS）为主的含氧产物，ROS 通过影响Cu2+调控过程进而引起DNA损伤；乙烯基－氨基甲酸乙酯会转化形成可与DNA 共价结合的加聚物，进而导致细胞癌变[9-10]。近年来，EC 的毒理学研究也开始转向细胞模型及人体组织。有研究表明，细胞中的信号转导和转录激活因子3（Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3）、核转录因子κB（Nuclear transcription factor-κB,NF-κB）[11-13]及细胞外信号蛋白调节激酶（Extracellular signal-regulated kinase,ERK）[14]等参与了EC 诱导细胞癌变的过程；EC 也可以通过诱导氧化应激、破坏膜完整性以及破坏DNA 和蛋白质结构等多种途径引起机体毒性效应[15-16]。

随着人们生活水平不断提高，居民的日常饮食模式也逐渐发生转变，其中饮用酒及其他发酵食品的消费量大幅度提高。根据国际食品添加剂法典委员会统计数据表明[17]，人体从酒精饮料中摄入的EC含量高达65 ng/kg·d，而从其他发酵食品中摄入的EC 含量仅为15 ng/kg·d。酒精饮料中EC 的高含量使得许多国家已开始制定控制措施，以有效控制人体摄入高含量EC。虽然目前欧盟还未建立EC 限量标准，但许多国家就发酵酒中的EC 含量设定了自己的标准。例如，加拿大政府和捷克共和国对不同酒精饮料中的EC 最高残留量进行了设定，包括葡萄酒30 μg/L、蒸馏酒150 μg/L、清酒200 μg/L 和水果白兰地400 μg/L；日本对葡萄酒、蒸馏酒以及水果白兰地的EC 限量标准与加拿大相同，但对清酒中EC 含量设定为最高100 μg/L。此外，美国、韩国、巴西、德国、法国、英国及瑞士也限定了部分酒精饮料中EC的最高含量[18-19]，具体如表1所示。

表1 不同国家酒精饮料EC限量

Chen[20]在2007 年和2009 年分别开展了第四次和第五次中国总膳食研究（The China Total Diet Study，TDS），在两次调查研究中，首次对我国酒精饮料中的EC 进行了分析研究，调查样品取自全国16 个省份，代表了中国各省的平均饮食模式，覆盖中国总人口的60 %左右。调查结果表明第五次TDS 酒精饮料中的平均EC 水平（19.8 μg/kg）高于第四次TDS（8.5 μg/kg），约增长1.3 倍，且在第五次TDS 中，中国人口中EC 的膳食摄入量约为平均人口8.27 ng/kg·d，高消费者约为45.67 ng/kg·d。此外，对北京市售的47份白酒样品的调查显示，EC的检出率为100%，EC的平均含量为63.0 μg/L[21]；浙江酒精饮料中的EC含量范围为2～515 μg/kg，包括黄酒中EC平均浓度160 μg/kg，米酒为87 μg/kg，白酒为72 μg/kg，葡萄酒为16 μg/kg，啤酒为2 μg/kg[1]。随着我国白酒产业日益壮大以及消费量的增加，白酒中EC 的存在不仅会给消费者带来健康隐患，更会阻碍我国传统白酒国际化的进程，然而我国对于酒精饮料中EC的研究仍然处于数据积累阶段。

2 白酒中氨基甲酸乙酯代谢机制

白酒中EC 的形成由多因素调控。首先，EC 的形成需要前体物质提供可与乙醇发生反应的氰酸盐以及具有氨甲酰基官能团的化合物等；其次，EC形成也与发酵过程中的微生物息息相关。目前已经发现的EC 前体物质主要有尿素、瓜氨酸、氰化物、氨甲酰磷酸。林宜锦等［23］的研究表明，尿素、瓜氨酸与氨甲酰磷酸这3 种前体物质由发酵过程中微生物生长代谢等过程积累产生，而氰化物则主要由原料带入并经过酶促反应生成EC。这些前体物质在不同香型白酒中对形成EC 的贡献程度有所差异，主要取决于发酵微生物的组成体系及其协同代谢过程[23]。

2.1 EC的尿素形成途径

Lin[24]对白酒中EC 及不同前体物质进行相关性分析发现，尿素与EC 相关性最强(r=0.92，P＜0.01)，其次是氰化物(r=0.61，P=0.02)，瓜氨酸与EC的相关性最弱，说明尿素是白酒中EC 形成最主要的前体物质，且尿素存在于白酒酿造的各个阶段（发酵、蒸馏、贮存）。尿素的主要来源有两方面：一是以高粱为主的酿酒原料带入；二是酵母菌代谢精氨酸产生尿素[25]。酵母菌代谢精氨酸在供应自身生长繁殖以及进行乙醇代谢反应的过程中会积累大量尿素，其中少量尿素用以供应酵母细胞的生长需求，其余的尿素则被分泌至细胞外并进入糟醅中，从而导致糟醅中尿素含量显著增加[26-27]。白酒酿造不同阶段的尿素会通过不同途径与乙醇反应从而生成EC：（a）发酵阶段，尿素与乙醇在酸性条件下缓慢反应并积累EC，该反应速率随发酵温度的升高而逐渐加快，研究表明，酒精饮料在发酵过程中EC 与尿素浓度的变化基本同步[28]；（b）蒸馏阶段，虽然EC 是在发酵过程中产生的，但由于EC 的沸点较高，难以达到蒸馏温度，因此发酵过程中产生的EC 只有一小部分进入白酒中，而当含有尿素和乙醇等物质的混合溶液温度达到60～100 ℃时，混合溶液中的尿素分解并产生氰酸盐、异氰酸盐以及氢氰酸和氨气，其中氢氰酸能与乙醇反应积累EC，氰酸盐、异氰酸盐在酸性条件下也可以与乙醇反应生成EC[29-30]，因此，白酒中的EC 主要是在蒸馏过程中产生的，蒸馏过程中形成的EC 是白酒基酒中EC 的重要组成部分；（c）贮存阶段，在白酒贮存过程中，酒体中未完全反应的尿素等前体物质也会与乙醇进行持续缓慢反应，从而形成EC。EC 的尿素形成途径如图1所示。

图1 EC的尿素形成途径

EC 的尿素合成途径中，除原料中直接分解产生的尿素之外，酵母菌代谢精氨酸生成尿素途径也十分重要。白酒发酵体系中精氨酸的来源是多样的，发酵原料不仅能为发酵菌群提供其生长繁殖所需要的营养和能源，也是构成精氨酸的物质来源，要积累大量的精氨酸，需要有适量的碳源和氮源。碳源来自碳水化合物，用于合成菌群所需的糖类、脂肪以及次级代谢产物；氮源来自含氮化合物，用于合成菌体的蛋白质、核酸、酶以及其他初级或次级代谢产物。在白酒实际生产过程中，发酵池中微生物群落是由自然环境中长期积累而形成的稳定系统，因此，要控制尿素-EC 途径中EC 的形成，可根据发酵成本及微生物群落特点选择合适的碳源和氮源。

2.2 EC的瓜氨酸形成途径

有研究表明，葡萄酒中EC 形成的主要原因为精氨酸代谢[31]。由于葡萄中含有丰富的精氨酸，其可被葡萄酒发酵过程中的微生物代谢形成尿素或瓜氨酸。在葡萄酒及水果白兰地的研究中发现，瓜氨酸可与乙醇反应生成EC[32]，可见瓜氨酸也是发酵食品中EC 的主要前体物质之一。白酒酿造过程中瓜氨酸的主要来源有两方面：（a）由酿酒原料带入，Fang[33]发现浓香型白酒的主要原料高粱中瓜氨酸的含量为82.5 mg/kg，其含量几乎是其他酿造原料（小麦、玉米、大米、糯米）的两倍；Caoet[34]通过模拟白酒固体发酵条件，分析了不同品类高粱原料在发酵过程中EC 形成及其前体物质的变化规律，结果表明瓜氨酸和尿素是由高粱进行发酵的白酒中EC 形成的主要前体物质，不同品种高粱发酵过程中瓜氨酸含量变化有明显差异，而糯高粱的平均EC 形成率是粳稻高粱平均EC 形成率的1.6 倍，说明由原料带入的瓜氨酸是白酒酿造过程中EC 形成的主要前体物质之一；（b）精氨酸经乳酸菌代谢从而形成瓜氨酸，在白酒发酵阶段，乳酸菌会将酿造原料中的精氨酸代谢生成瓜氨酸，该过程中属于精氨酸脱亚胺酶途径的精氨酸降解，又可称为ADI途径（Arginine deiminase pathway，ADI）[35]，适宜的条件下瓜氨酸通过ADI 途径之后将进一步代谢为鸟氨酸、氨以及二氧化碳，并产生腺苷三磷酸（Adenosine triphosphate，ATP）；但当发生环境胁迫时，瓜氨酸的代谢途径受阻，从而导致瓜氨酸积累[36-38]并被分泌到细胞外，进而与糟醅中的乙醇反应生成EC。EC的瓜氨酸形成途径如图2所示。

图2 EC的瓜氨酸形成途径

白酒酿造原料中瓜氨酸以及发酵体系中的精氨酸含量都能影响白酒中EC 的形成，发酵体系中的精氨酸含量不仅能影响EC 的尿素形成途径，也能影响EC 的瓜氨酸合成途径，其区别在于发酵体系中菌种不同。之前的研究表明白酒中EC 形成的主要途径为尿素合成途径和瓜氨酸合成途径，但目前很少有研究对原料中不同氨基酸含量进行分析，且白酒发酵体系中微生物群落变化规律及不同种类微生物功能研究依然处于初步研究阶段。如何控制白酒中EC的形成，可从降低原料中EC前体物质以及微生物鉴定及选育途径进行研究。

2.3 EC的氰化物形成途径

氰化物是发酵食品中EC 的另一种前体物质，有研究表明白兰地中EC 是由乙醇和氰化物氧化产生[25]，一些富含生氰糖苷的核果蒸馏酒中EC 形成的主要前体物质也是氰化物。氰化物是通过植物原料中氰苷的酶促或酸热分解产生的，其能够以氰酸、氢氰酸以及含氰基的化合物等多种形式存在，上述任何形式均能与乙醇发生反应从而生成EC[29-30，39]。研究显示，部分蒸馏酒发酵过程中原料中的生氰糖苷可通过加热裂解形成氰化物，也可在微生物代谢过程中通过酶促反应生成氰化物[40]，此后氰化物被氧化生成氰酸盐[41-42]，氰酸盐在催化剂如光照、氧气或Cu2+等作用下与乙醇反应进而生成EC[43]。中国白酒酿造工艺独特且复杂，这导致白酒中EC 的形成机制比其他蒸馏酒更为复杂。通过对白酒中EC 前体物质的变化规律进行分析发现瓜氨酸和尿素是高粱固态发酵过程中EC 形成的主要前体物质，氰化物并未参与EC 的形成[44]。目前的研究并未明确指出氰化物是白酒中EC 形成的主要前体物质，但氰化物能以不同形式参与白酒中EC 的形成，对于白酒中EC 含量变化具有一定影响。未来需要对白酒酿造原料以及不同酿造阶段中氰化物的不同形式进行分析，从而对氰化物是否为白酒中EC 的前体物质进行确定，并制定相应措施对该途径形成EC 进行控制。EC 的氰化物形成途径如图3所示。

2.4 EC的氨甲酰磷酸形成途径

氨甲酰磷酸（Carbamoyl phosphate,CP）是高能磷酸化合物之一，由二氧化碳和氨消耗ATP 形成。氨甲酰磷酸主要为多种生物合成途径提供氨甲酰基团，其中尿素的产生以及精氨酸的尿素/精氨酸途径均有氨甲酰磷酸的身影[45-46]。研究发现，产生氨甲酰磷酸的酶有3 种，包括氨甲酰磷酸合成酶（Carbamoyl phosphate synthetase，CPS）的两个亚型CPS-A、CPS-P 以及具有合成代谢作用的氨甲酰激酶（Carbamate kinase，CK）[47-49]。早在19 世纪，Ough 的研究就已经表明，在发酵食品中，氨甲酰磷酸盐能够与乙醇反应生成EC，而氨甲酰磷酸盐的生成过程在酵母细胞中进行，主要由氨甲酰磷酸合成酶催化CO2、氨以及ATP 形成[50]。Allen 和Jones的研究表明，氨甲酰磷酸在不同pH 条件下分解产物不同：在酸性条件下(pH2.0～4.0)可水解为氨气、正磷酸盐，可能还有CO2；碱性条件下(pH6.0～8.0)可水解为氰酸盐和正磷酸盐[51]。部分发酵食品能利用氨甲酰磷酸形成EC，但在常规的酒精饮料中，氨甲酰磷酸并不是主要的EC 前体物质。目前还未有相关研究报道氨甲酰磷酸是白酒中EC 形成的主要前体物质，仅有部分研究显示氨甲酰磷酸参与白酒中EC 的形成。且由于我国白酒酿造工艺复杂，整个酿造过程受多因素调控，白酒中氨甲酰磷酸的EC 形成途径仍需进一步研究。EC 的氨甲酰磷酸形成途径如图4所示。

图4 EC的氨甲酰磷酸形成途径

3 影响白酒中氨基甲酸乙酯形成的因素

与其他蒸馏酒相比，中国白酒的发酵工艺更为复杂，且不同香型白酒的酿造方法以及各地区生态环境不同引起的微生物差异导致我国白酒酿造工艺具有独特且复杂的特性。虽然不同香型的白酒原料和酿造方法不同，但其前体物质是相同的，EC生产机理可能相似。根据白酒酿造时间不同，分别对发酵期、蒸馏期以及贮存期影响白酒中EC 形成的因素进行探讨，可以明确白酒酿造各个阶段中EC 形成原因，白酒企业可结合生产实际情况形成EC 有效调控措施，对促进我国白酒行业有序良性发展具有重大意义。

发酵期：白酒酿造原料丰富多样，其中浓香型、酱香型白酒需要的原料更加复杂，导致原料中带入的EC 前体物质含量相对增加。其次，发酵过程中温度、时间、pH 值、乙醇含量以及微生物种群差异均会影响白酒中EC 的生成。研究显示，在酱香型白酒生产过程中，EC 含量在原料的高温堆积和发酵过程中不断增加，且越接近发酵后期，EC 形成速率越快；芝麻香型白酒的EC 变化与酱香型白酒相似，但EC生成率比酱香型白酒高3倍[52]。另一项研究表明，酿造3 个月至1 年的浓香型、酱香型、混合香型白酒中EC 的含量高于酿造1 个月的清香型和米香型白酒[53-54]，表明在发酵过程中EC的生成受发酵温度、发酵时间的调控。此外，Arena[37]发现乙醇含量和pH 会影响精氨酸和瓜氨酸的代谢，进而影响EC 的形成。随着研究的深入，越来越多的研究者发现微生物也是影响酒中EC 含量不可忽视的因素[55]。

蒸馏期：EC 的沸点高达184 ℃，但我国白酒蒸馏温度为100 ℃，因而在白酒蒸馏初期，由发酵阶段带入的EC含量相对较少，蒸馏阶段EC主要依靠以乙醇为主的混合溶液中EC 前体物质在高温条件下与乙醇反应形成。有研究显示，白酒蒸馏前期EC 来源于发酵阶段带入，蒸馏后期EC 来源于其前体物质与乙醇反应生成[56]。此外，Fang[33]发现由于瓜氨酸沸点低于尿素，其在白酒蒸馏过程中更易影响EC 含量。此外，氰醇可在60 ℃左右条件下分解为氰化物，蒸馏过程中的氰化物可生成氰酸盐，其与乙醇反应可生成EC。

贮存期：我国白酒贮存过程中EC 形成主要取决于贮存温度、前体物质、贮存时间等。张莹等[57]的研究表明，贮存温度是短期内影响白酒基酒中EC含量变化的主要原因之一；对黄酒和葡萄酒的研究表明，EC生成速率随贮存温度的升高而加快[53]。除贮存温度以外，贮存过程中EC 前体物质含量也是影响白酒贮存过程中EC 的主要原因，研究发现不同贮存年限浓香型白酒基酒中EC 含量增加的同时，尿素及瓜氨酸的含量降低，且EC含量变化与尿素、瓜氨酸含量变化具有显著相关性[35]；Fang[33]的研究证实尿素是白酒基酒贮存期EC 形成的关键前体物质。此外，张顺荣[58]发现白酒贮存时间也会影响EC 的生成，且经线性拟合及相关性分析发现氰化物是白酒贮存过程中EC 的最主要前体物质。由此可见，目前关于白酒贮存过程中EC 主要前体物质的结论并不统一，后期可加大对白酒基酒贮存期间EC形成机制的研究，为制定合理控制白酒EC含量的措施提供理论基础。

根据已有研究以及EC 的形成途径可对白酒酿造不同阶段影响EC 形成的因素进行区分，对白酒实际生产具有指导作用。对白酒中EC 含量的控制，首先应对原料中不同的前体物质进行检测并确定其含量，并根据实际生产情况调整原料配比；其次，对发酵体系中氮源、碳源进行调控，确定微生物的种类及不同发酵时间段中优势菌群的变化规律，进一步分析不同前体物质作用阶段以及明确EC 生成的主要途径；最后，对蒸馏阶段及贮存阶段不同生产条件下EC 的含量以及前体物质含量变化规律进行分析，根据实际情况调整生产工艺，进而降低白酒中EC的生成。

4 总结与展望

酒精饮料中EC 污染普遍存在，我国黄酒及白酒的EC 暴露风险明显高于其他酒精饮料。我国在2012 年才开始对酒精饮料中的EC 污染给予重视，目前仍然处于初步研究阶段。近年来白酒在我国酒精饮料市场上的占比逐渐增大，白酒食品安全显得尤为重要。明确白酒中EC形成机制、影响因素，白酒企业可根据实际生产情况，寻找有效控制EC的方法以及制定相关标准，以保证我国白酒产业持续健康发展。

国内外对发酵酒和部分蒸馏酒中EC 的形成途径及控制方法进行了相对全面的研究，由于白酒生产的独特性和复杂性，白酒酿造过程中EC 形成机理及控制措施等研究依然处于起步阶段，未来可着重研究以下两方面：首先，对白酒酿造过程不同阶段EC 形成途径进行全面且深入的研究，明确不同前体物质、酿造工艺等对EC形成的影响，为探索相应的EC控制措施提供数据支持；其次，完善白酒中EC 风险评估方法，应进行相关毒理学研究，了解机体EC 摄入量及表征反应等关系，从而开展人体肿瘤风险预测，形成科学的EC风险评估体系，并为我国建立酒精饮料中EC 限量标准提供理论基础，为白酒安全管理提供指导依据。