气相色谱和气相色谱-质谱法检测国际比对干邑白兰地中21种挥发性成分

陈 科，汪廷彩，梁 言，孙文佳，刘鸿钢，黎欣欣，周忆莲，雷 毅

(广东省食品检验所，广东广州 510435)

白兰地是以葡萄为原料，经发酵、蒸馏、橡木桶陈酿、调配而成的蒸馏酒[1-2]。白兰地含有醇类、酯类和醛类等多种风味物质，其含量及其之间的相互作用是影响白兰地品质和风味的主要因素。不同国家的白兰地以法国的最为驰名，且以干邑最为优质。干邑白兰地经过橡木桶陈酿以及自身的氧化、水解等过程，挥发性成分发生了变化，最终发酵成具有花香和果香、品质醇美的法国干邑酒，因此挥发性物质是分辨干邑白兰地风格差异、真伪鉴别与质量优劣的重要指标[3-13]。法国国家干邑专业协会Bureau National Interprofessionnel du Cognac 每年组织两次国际间比对，组织方利用法国干邑属地优势制备酒样，通过向各国实验室发放样品开展实验室间比对活动，其目的在于提升法国当地干邑酒的品质，更旨在考核和评价各参试实验室检测干邑白兰地挥发性成分的技术能力[14-16]。

国内外学者对不同品类酒测定其挥发性成分进行了相关研究，得出应用不同检测技术可以分析各挥发性成分的含量及其间差异[17-20]。曾朝珍等[21]采用液液萃取和气相色谱-质谱联用技术对不同陈酿时间的苹果白兰地中风味物质进行测定，表明不同大类的苹果白兰地呈现出不相同的风味特征；付安珍等[22]采用气相色谱-质谱联用技术对4 种杏白兰地的香气成分进行分析和比较，得到不同品种的杏对杏白兰地香气成分有很大影响；王斌等[23]采用顶空固相微萃取（HS-SPME）和气相色谱-质谱联用技术分离并分析了4 种不同苹果白兰地酒的香气成分；赵志聪等[24]采用HS-SPME 和气相色谱-质谱联用法，对苹果白兰地一次蒸馏不同馏分中的香气成分进行分析。

目前国内白兰地中挥发性物质的检测分析主要参照GB/T 11856—2008《白兰地》[25]，采用气相色谱法和滴定法测定挥发性成分[26-27]。由于滴定法操作较为繁琐耗时，不能很好解决国际比对样品测试量有限、样品开封后不易保存、报送时间较短等检测技术问题。气相色谱和气相色谱-质谱联用技术具有操作简单、所需待测挥发性成分样品量少、灵敏度高的特点，因此本文选用气相色谱（gas chromatography,GC）和气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS）技术测定国际比对干邑白兰地中各挥发性成分，保证测试过程定量分析结果的准确、可靠。通过参加国际实验室间比对，能更好了解自身检测技术能力与国际检测整体水平的差距，有利于保证检测结果准确、有效，同时为实验室开展常态化外部比对以及为同行实验室开展该类测试提供方法学依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：N°61、N°60、N°59 干邑白兰地酒样，均由法国Bureau National Interprofessionnel du Cognac提供。N°61为测试样品，N°60和N°59为留样。

试剂及耗材：乙酸乙酯(纯度99.57%)、乙缩醛(纯度99.44%)、正丙醇(纯度99.73%)、活性戊醇(纯度99.8 %)、正己醇(纯度99.69 %)、癸酸乙酯(纯度99.6 %)、仲丁醇(纯度99.87 %)、正丁醇(纯度99.80 %)、顺式-3-己烯醇(纯度99 %)、4-甲基-2-戊醇(纯度98.52 %)、乙酸正戊酯(纯度99.2 %)，Dr.Ehrenstorfer 标准品；异丁醇(纯度99.9 %)、异戊醇(纯度99.9 %)、乳酸乙酯(纯度99.7 %)、糠醛(纯度99.8 %)、甲醇(纯度99.9 %)、异丁醛(纯度99.8 %)、丁酸乙酯(纯度99.8%)、叔戊醇(纯度99.7%)，坛墨质检科技股份有限公司；辛酸乙酯(纯度99.4 %），天津阿尔塔科技有限公司；月桂酸乙酯(纯度99.7 %），美国CATO Research Chemicals Inc；无水乙醇(色谱纯），天津市康科德科技有限公司；实验用水为Milli-Q超纯水。

仪器设备：7890B 气相色谱仪，8890 气相色谱仪，均配氢火焰离子化检测器，7890B-5977B 顶空固相微萃取-气相色谱质谱联用仪，毛细管色谱柱CP-Wax 57，美国Agilengt 公司；Milli-Q 超纯水机，美国Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准溶液的配制

（1）称取适量乙醛、乙酸乙酯、乙缩醛、丁酸乙酯、仲丁醇、正丙醇、异丁醇、正丁醇、活性戊醇、异戊醇、乳酸乙酯、正己醇、辛酸乙酯和糠醛标准品，用60 %乙醇溶液定容至刻度，配制成质量浓度为20 g/L 的标准混合储备液。移取适量标准混合储备液稀释至刻度，配制成200 mg/L标准溶液。

（2）称取适量异丁醛、丁酸乙酯、仲丁醇、正丁醇、正己醇、顺-3-己烯醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯标准品，用60%乙醇溶液定容至刻度，配制成质量浓度为2 g/L 的标准混合储备液。移取适量标准混合储备液稀释至刻度，配制成10 mg/L 标准溶液。

（3）称取适量甲醇标准品，用40%乙醇溶液定容至刻度，配制成质量浓度为5000 mg/L 的标准储备液。移取适量标准混合储备液稀释至刻度，配制成200 mg/L标准溶液。

（4）称取适量乙酸正戊酯、4-甲基-2-戊醇和叔戊醇标准品，用60%乙醇溶液定容至刻度，分别制成质量浓度为200 mg/L和10 mg/L的内标溶液。

1.2.2 样品前处理

移取比对酒样至10.0 mL 容量瓶，加入100 μL内标储备液，充分混匀后，待测。

1.2.3 仪器条件

1.2.3.1 气相色谱条件

色谱柱：CP-Wax 57 CB(50 m×250 μm×0.2 μm)；氢火焰离子化检测器(FID)；检测器温度为280 ℃；载气为He，尾吹气，N2尾吹流量30.0 mL/min，空气流量350.0 mL/min，氢气流量35.0 mL/min，进样为分流模式，载气为N2，吹扫流量3.0 mL/min，色谱柱流量1.0 mL/min。进样量0.2 μL。7890B 用于检测13 种挥发性成分，8890 用于测定甲醇。不同仪器型号的气相色谱参数与升温程序，见表1。

表1 不同气相色谱参数与升温程序

1.2.3.2 气相色谱质谱联用仪条件

（1）色谱条件。进样口温度：220 ℃；载气：高纯氦(纯度＞99.999%)，流速1.5 mL/min；氢气流速35.0 mL/min。空气流速350.0 mL/min；升温程序：初始温度40 ℃，恒 温5 min，以10 ℃/min 升 至100 ℃，恒温1.5 min，以15 ℃/min升至220 ℃，恒温10 min；进样量1 μL。

（2）质谱条件。电离方式：电子轰击电离源（EI）；电离能量：70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；监测方式：选择离子扫描(SIM)。溶剂延迟3.5 min。挥发性物质标准溶液的质谱参数，见表2。

表2 挥发性物质的色谱保留时间与质谱参数

2 结果与分析

2.1 检测方法的选择

实验室对N°61 国际比对干邑白兰地中挥发性成分测定进行预实验，首先采用气相色谱法测定挥发性成分乙醛、甲醇、乙酸乙酯、乙缩醛、正丙醇、异丁醇、活性戊醇、异戊醇、乳酸乙酯、糠醛、正己醇、辛酸乙酯、异丁醛、仲丁醇、正丁醇、丁酸乙酯、顺-3-己烯醇、月桂酸乙酯。初测结果表明，异丁醛、仲丁醇、正丁醇、丁酸乙酯、顺-3-己烯醇、癸酸乙酯和月桂酸乙酯挥发性成分含量较低，以气相色谱仪的检测灵敏度不足以对其含量进行准确定量分析。因此，将上述挥发性成分采用灵敏度更高的气相色谱-质谱联用仪重新定量测定，选用乙酸正戊酯、4-甲基-2-戊醇作为内标物，通过优化色谱类型、升温程序等仪器条件，最终得到一种具有良好定量测定6 种挥发性成分效果的方法。甲醇参考GB 5009.266—2016[28]，样品经气相色谱分离，氢火焰离子化检测器检测，叔戊醇为内标，内标法定量。其余的醇类、酯类和醛类挥发性成分采用气相色谱法测定。

2.2 色谱条件的优化

由于个别挥发性成分如异丁醛检测过程容易受杂质峰干扰，癸酸乙酯测定过程容易受升温程序和基质效应[29]影响。因此调整和优化气相色谱条件的流速和升温程序，使干邑酒中挥发成分逐个分离。由图1—图3 可知，经色谱条件优化，14 种挥发性物质标准溶液能初步分离，为了提高检测灵敏度，通过配制低浓度内标物进行曲线校准后内标法定量分析，能更好将低浓度的异丁醛、丁酸乙酯、仲丁醇、正丁醇、正己醇、顺-3-己烯醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯9 种挥发性成分有效分离。甲醇优化升温程序，能对样品该成分进行准确分析和色谱分离。上述挥发性物质的气相色谱信息，结果见表3。

图1 14种挥发性物质标准溶液及其内标（200 mg/L）的气相色谱图

图2 9种挥发性物质标准溶液及其内标（10 mg/L）的气相色谱图

图3 甲醇标准溶液及其内标气相色谱图

表3 各种挥发性物质的保留时间、峰面积和峰高

2.3 质谱参数的优化

由图4 可知，异丁醛、仲丁醇、正丁醇、丁酸乙酯、顺-3-己烯醇、正己醇、辛酸乙酯、癸酸乙酯和月桂酸乙酯经过质谱条件优化，均能有效分离。

图4 9种挥发性物质标准溶液及其内标(10 mg/L)的总离子流色谱图

2.4 方法的线性回归方程

移取1.2.1（3）标准混合储备液稀释至刻度，配制成0.5 mg/L、1.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L 的系列混合标准工作溶液。移取适量1.2.1（4）标准混合储备液稀释至刻度，配制成100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L、800 mg/L、1000 mg/L的系列混合标准工作溶液，在优化条件下测定。由表4 可知，低浓度挥发性成分经校准，其在各自的质量浓度范围内均呈良好的线性关系，相关系数r2≥0.9990。

表4 挥发性成分的线性回归方程和相关系数

2.5 精密度试验

考察检测方法的重复性，取N°61 样品进行精密度试验，同一份样品平行独立操作两次，连续平行测定6 次，计算组内相对标准偏差RSD。由表6可知，N°61 中各挥发性成分的RSD 均在0.0 %～2.2%内。结果表明，该方法的精密度较好，具有较好的重复性，可用于干邑白兰地挥发性成分的测定。

2.6 留样复测

取N°60 和N°59 比对样品进行留样复测，按照“1.2.2”进行样品的处理和测定，同一份样品平行独立操作两次，取其平均值，测定结果与N°60、N°59的指定值与满意值范围相比。由表5 可知，N°60 和N°59 检测数值在满意范围内，证明优化的检测方法能满足国外比对要求。

表5 N°59和N°60留样复测的测定结果与评价

2.7 比对样品测试

气相色谱法和气相色谱-质谱法同时测定N°61干邑比对样品挥发性成分，平行双样测定后取其平均值为最终结果。比对结果返回后，对N°61 的检测结果进行评价。由表6 可知，N°61 国际比对样品中10 种醇类、6 种酯类和5 种醛类共21 个参数的测定数据均在允许范围内，结果满意。

表6 N°61的测定结果与评价

3 结论

采用气相色谱和气相色谱-质谱联用分析技术，综合考察仪器灵敏度、基质效应等影响，分别优化色谱条件和质谱参数，通过精密度试验和留样复测，检测国际比对干邑白兰地中醇类、酯类和醛类等挥发性成分。结果表明，该方法操作简便、灵敏度高、精密度高、选择性和线性关系良好，适用于干邑白兰地中挥发性成分的检测。同时应经常鼓励实验室参与高水平的国际比对，有助于实验室及时发现存在问题，提高检测分析能力，保证实验室质量与控制水平，缩小与国际先进实验室间的技术水平差距。