麻竹笋壳不溶性膳食纤维理化特性及其体外酵解对肠道微生物的影响

刘东杰，周心雨，王锋，余元善，2*，肖更生，2，马路凯，3*

（1.农业农村部岭南特色食品绿色加工与智能制造重点实验室，仲恺农业工程学院轻工食品学院，广东 广州 510631；2.广东省农业科学院 蚕业与农产品加工研究所，广东 广州 510610；3.西藏自治区农牧科学院农 产品开发与食品科学研究所，西藏 拉萨 850000）

竹笋，禾本科竹亚科多年生常绿植物，原产于我国。竹笋营养丰富，具有高纤维、低脂肪、高蛋白的特点，在亚洲地区颇受喜爱。此外，竹笋也具有多种生理功能，如抗菌、抗糖尿病、抗肿瘤、预防心血管疾病和神经性疾病等[1]。

约60%竹笋被加工成笋干、清水笋、盐渍笋等[2]，其中竹笋壳作为加工副产物，常用作动物饲料或直接丟弃，间接对环境造成极大的污染[3]。笋壳中富含人体第七大营养素——膳食纤维素，笋壳作为包裹笋肉的部分，其中的膳食纤维含量丰富，是膳食纤维制备的良好来源，具有降低血压、降低血糖、减肥、防治冠心病等积极作用[1]。目前对于竹笋壳的深加工主要集中在膳食纤维提取、理化性质、结构特性、生物活性等方面。Zheng 等[4]提取竹笋壳膳食纤维后应用于降血糖作用的研究。Luo 等[5-6]提取竹笋壳不溶性膳食纤维并进行改性，研究其结构和功能特性，发现笋壳膳食纤维对小鼠有降血脂作用。林良美[7]提取笋壳活性膳食纤维后应用于降糖降脂功能研究。膳食纤维虽然不能被人体消化道酶消化，但能够被大肠内微生物部分或全部发酵产生短链脂肪酸，诱导好氧有益菌增殖，抑制厌氧腐败菌繁殖，可有效改善肠道菌群[8]。

目前的研究主要集中在毛竹笋或福建产竹笋，对广东地区特产麻竹笋的研究较少。麻竹笋又名笋王，产自广东地区，其个头大、肉质厚、味甘鲜脆、营养丰富，是笋中佳品。麻竹笋加工过程中产生的大量笋壳废弃物，是一种潜在的廉价、优质膳食纤维来源。本文提取麻竹笋壳膳食纤维，并对其不溶性膳食纤维（insoluble dietary fiber，IDF）的结构特点、水化特性、持油力、胆固醇吸附能力、葡萄糖吸附能力、α-淀粉酶抑制能力、体外模拟发酵对胃肠微生物的影响进行研究，以期为开发其在食品加工领域的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

麻竹笋壳：云浮市健安食品发展有限公司；葡萄糖、胆固醇、二硝基水杨酸、福林-消卡、芦丁（生化试剂）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；乙醇、乙酸乙酯、甲醇（均为分析纯）：北京索莱宝科技有限公司；纤维素酶（≥0.3 U/mg）、中性蛋白酶（≥10 U/mg）、α-淀粉酶（≥5 U/mg）：美国Sigma-Aldrich 公司。

1.2 仪器与设备

Bio-Tek ELx808IU 全自动酶标仪、1260 Infinity II高效液相色谱仪：美国安捷伦科技有限公司；IKARV05 旋转蒸发仪：艾卡（广州）仪器设备有限公司；Scientz-10ND 真空冷冻干燥机：宁波新芝冻干设备股份有限公司；Zeiss Merlin Compact 扫描电子显微镜：德国蔡司股份有限公司；Spectrum 100 傅立叶红外光谱分析仪：美国珀金埃尔默股份有限公司；MIX-25 涡旋仪：杭州佑宁仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 原料预处理

新鲜麻竹笋壳经挑选、清洗，60 ℃干燥后粉碎，过100 目筛，分袋装好并密封，置于干燥避光处保存备用。

1.3.2 不溶性膳食纤维提取

取笋壳粉按照料液比1∶24（g/mL）加水，调节pH值至6.0，超声（40 ℃、400 W）辅助提取30 min。然后添加0.7%混合酶（纤维素酶、中性蛋白酶、α-淀粉酶质量比1∶1∶1），40 ℃条件酶解1.5 h，100 ℃水浴10 min 灭酶，冷却至室温后，5 000 r/min 离心10 min 处理获得沉淀，冷冻干燥即得IDF。

1.3.3 理化性质测定

1.3.3.1 持水力

准确称取0.5 g IDF 样品，与20 mL 蒸溜水混合加入到50 mL 离心管中，振荡均匀，放置24 h，以4 000 r/min离心10 min，弃上清液后称重沉淀物，持水力（A，g/g）的计算公式见公式（1）。

式中：W1为样品持水后质量，g；W2为样品质量，g。

1.3.3.2 膨胀力

准确称取1.0 g IDF 样品，置于100 mL 量筒中，然后量取50 mL 蒸馏水加入其中。经充分振荡，室温静置24 h，读取样品体积，并按公式（2）计算样品的膨胀力（B，mL/g）。

式中：V1为样品最终的体积，mL；V2为样品初始的体积，mL；m 为样品质量，g。

1.3.3.3 持油力

准确称取1.0 g IDF 样品，放入50 mL 离心管中，量取20 mL 大豆油加入其中，在37 ℃下浸泡1 h，每隔10 min 搅拌1 次，于4 800 r/min 下离心10 min，弃去上层油和其它物质，滤纸吸去管壁悬浮的油，残余物称重，并以公式（3）计算样品的持油力（C，g/g）。

式中：M1为样品湿重，g；M2为样品干重，g。

1.3.4 结构分析

1.3.4.1 扫描电镜观察

将样品在自然空气循环中干燥并固定于电磁胶带上，喷金处理后，置于扫描电子显微镜下，以20 kV电子束观察拍摄。

1.3.4.2 傅里叶红外光谱测定

将IDF 样品与溴化钾（KBr）粉末（质量比1∶100）混合，压成颗粒进行光谱测量，光谱测量分辨率2 cm-1，扫描次数32，扫描范围为4 000～400 cm-1。

1.3.4.3 分子量测定

称取5 mg 样品，加入1 mL 0.2 mol/L NaOH 溶液，在120 ℃条件下水浴1 h，再加入500 μL 0.2 mol/L 的NaOH 溶液充分溶解，调节pH 值至中性，向样品中加入0.05 mol/L NaCl 溶液，配制成5 mg/mL 供试样品溶液，以12 000 r/min 离心10 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜过滤，得到待测样品溶液。

采用高效液相凝胶渗透色谱（high performance liquid gel permeation chromatography，HPGPC）法测定。色谱条件：RI-10A 示差检测器；BRT105-104-102 串联凝胶柱（8 mm×300 mm）；流动相为0.05 mol/L NaCl 溶液；流速为0.6 mL/min；柱温40 ℃；进样量20 μL。以标准分子质量葡聚糖的分子质量对数为纵坐标，标准葡聚糖在色谱柱中的保留时间为横坐标绘制标准曲线。记录色谱图，依据IDF 样品在色谱图上的保留时间对照葡聚糖标准品分子量标准曲线计算其对应分子量。

1.3.4.4 单糖组成测定

采用离子色谱法测定。制样：精确称量IDF 样品（5.00±0.05）mg，加入1 mL 2 mol/L 三氟乙酸，121 ℃加热2 h。通氮气，吹干。加入甲醇清洗，再吹干，重复用甲醇清洗2～3 次。加入无菌水溶解，转入色谱瓶中待测。测定条件：色谱柱DionexTMCarboPacTMPA20（3.0 mm×150 mm，6 μm），柱温30 ℃；流速0.5 mL/min。进样量5 μL；运行时间60 min；流动相A 为0.1 mol/L NaOH；流动相B 为0.1 mol/L NaOH-0.2 mol/L NaOAc[9]。

1.3.5 功能特性的测定

1.3.5.1 胆固醇吸附力

取鸡蛋蛋黄，用9 倍质量的蒸溜水充分稀释，搅拌均匀形成乳液。取1.0 g IDF 样品与25 mL 稀释蛋黄液混合，将pH 值分别调至2.0 和7.0 模拟胃和肠道环境，37 ℃水浴振荡2 h，4 000 r/min 下离心10 min。随后采用邻苯二甲醛法在波长560 nm 处测定其对应的吸光值，平行测定3 次，最后按照公式（4）计算胆固醇吸附力（D，mg/g）。

式中：M1为吸附前胆固醇含量，mg；M2为吸附后胆固醇含量，mg；W 为IDF 质量，g。

1.3.5.2 葡萄糖吸附能力

取1.0g（W）样品加入浓度为0.1mg/mL 的100mL 葡萄糖溶液中，初始溶液葡萄糖浓度记为C1（mg/mL），充分搅拌，37 ℃恒温水浴6 h，5 000 r/min 下离心20 min，取2 mL 上清液（V，mL），采用二硝基水杨酸法在540 nm 波长处测定吸光值，上清液中葡萄糖浓度记为C2（mg/mL），计算吸附量。并用蒸馏水代替葡萄糖溶液以除去样品中的糖作为样品空白组，葡萄糖浓度记为C3（mg/mL）。按照公式（5）计算葡萄糖吸附能力（X，mg/g）。

1.3.5.3 α-淀粉酶抑制能力

将1.0 g IDF 样品与0.1 g α-淀粉酶溶液混合，加入25 mL 马铃薯淀粉溶液（4%），在pH7.0、37 ℃下振荡水浴1 h，4 800 r/min 下离心10 min，采用二硝基水杨酸法测定上清液中的葡萄糖含量。将不含样品的25 mL 马铃薯淀粉作为对照组，然后将蒸馏水代替马铃薯淀粉以除去样品中的糖作为样品空白组。α-淀粉酶抑制能力（Y，%）按照公式（6）计算。

式中：A1为含IDF 的上清液的吸光值；A2为对照组的吸光值；A3为样品空白组的吸光值。

1.3.5.4 结合多酚的含量

将1.0 g IDF 样品与40 mL 2 mol/L NaOH 在室温下混合1 h，用6 mol/L HCl 将pH 值调节至2.0，然后在4 800 r/min 下离心10 min，上清液用乙酸乙酯萃取3 次。将乙酸乙酯相在45 ℃旋转蒸发，直至体积≤5%后，将残留物溶解在甲醇中，并在-20 ℃的黑暗环境下储存。采用福林-消卡法在760 nm 处测定吸光值，没食子酸作为参考物质，结果以mg/g 表示。

1.3.5.5 黄酮含量

IDF 中黄酮的提取方法同1.3.5.4 中结合多酚的提取方法。在510 nm 处测定吸光值，结果以mg/g 表示。

1.3.6 麻竹笋膳食纤维的体外酵解试验

1.3.6.1 基础培养基的配制

参考柳芳伟等[10]的方法略有改动。分别将蛋白胨2.0 g、酵母提取物2.0 g、L-盐酸半胱氨酸0.5 g、胆盐0.50 g、NaCl 0.1 g、NaHCO32.0 g、KH2PO40.04 g、K2HPO40.04 g、MgSO4·7H2O 0.01 g、CaCl2·6H2O 0.01 g、氯化血红素0.02 g、吐温80 2.0 mL、维生素K110 μL 和树脂天青溶液（1.0%，厌氧指示剂）1.0 mL 溶于1 L 去离子水中，再用0.1 mol/L HCl 将pH 值调至7 后放置在121 ℃温度下灭菌15 min，放置备用。

1.3.6.2 麻竹笋膳食纤维的基础培养基配制

采用紫外灭菌方法对麻竹笋膳食纤维进行灭菌，将麻竹笋膳食纤维平铺后，放置在培养皿中，然后于超净工作台中正反面紫外照射30 min 进行灭菌处理。将灭菌后的麻竹笋膳食纤维溶于1.3.6.1 的基础培养基中，配制成麻竹笋膳食纤维浓度为10 mg/mL 的麻竹笋膳食纤维基础培养基。以低聚果糖（fructoolooligosaccharide，FOS）作为阳性对照培养基，配制方法与膳食纤维培养基一致。

1.3.6.3 体外酵解试验

自愿者要求：饮食正常、无肠道疾病且至少3 个月未接受过抗生素治疗的健康成年人，年龄需在20～30 岁。分别收集3 名自愿者的新鲜粪便，然后从每名自愿者提供的新鲜粪便中随机取等量后混合均匀，立即加入已灭菌的改良生理盐水（内含0.5 g/L 的L-盐酸半肮氨酸和9.0 g/L 的NaCl）中，配制成浓度为10%固液混合物，用手持均质器（刀具已灭菌）以3 000 r/min 转速均质1 min，再将均液以500 r/min 转速、4 ℃离心5 min，收集上清液并立即储存于厌氧盒中待用。

将36 个已灭菌的培养瓶分为3 组，每组12 个，分别将3 组记为A、B、C 组。向A 组发酵瓶中加入10 mL人体肠道菌群培养液和90 mL 麻竹笋膳食纤维基础培养基作为多糖发酵试验组，向B 组培养瓶中加入10 mL人体肠道菌群培养液和90 mL 含有FOS 的基础培养基作为阳性对照组，向C 组培养瓶中加入10 mL 人体肠道菌群培养液和90 mL 基础培养基作为空白对照组。将所有培养瓶置于涡旋仪上涡旋均匀，再置于厌氧盒中37 ℃培养，并分别在发酵培养0、6、12、24 h 同时取出A、B、C 各组的3 个发酵瓶取样，发酵液置于冰水浴中10 min 停止发酵，离心（9 000 r/min，4 ℃，10 min）收集上清液，-80 ℃储存待用[11]。

1.3.6.4 肠道菌群组成鉴定

将发酵后的样品送至上海伟寰生物科技有限公司，对其进行微生物群组成分析。选择16S rDNA 的V4 区进行扩增后用Illumina Miseq 进行高通量测序。使用微生物生态定量分析（QIIME）对原始的Illumina fastq 文件进行分解、质量过滤和分析。使用Vsearch 对操作分类单元（operational taxonomic units，OTUs）进行聚类，相似度97%。随后采用主坐标分析法（principal co-ordinates analysis，PCoA）和热图分析不同组别间肠道微生物群落产生的差异。

1.4 数据处理

试验设置3 次重复，结果以平均值±标准差表示。采用GraphPad Prism 8.0.2 软件作图。

2 结果与分析

2.1 理化特性分析

水化特性和持油力是衡量膳食纤维生理功能的两项重要指标，研究证明，水化特性越强，越有利于防止结肠癌和便秘的产生[12]。麻竹笋壳IDF 理化性质见表1。

表1 麻竹笋壳IDF 理化性质Table 1 Physicochemical properties of IDF from bamboo shoot shells

由表1 可知，麻竹笋壳IDF 拥有较好的水化性质，其持水力和膨胀力分别达到11.26 g/g、8.20 mL/g，优于常用麸皮膳食纤维标准（持水力4.00 g/g、膨胀力4.00 mL/g）[13]和松茸渣中提取得到的IDF（持水力2.78 g/g、膨胀力3.49 mL/g）[14]。良好的持水力有利于缩短食物残渣在肠道内的停留时间，从而促进排便；IDF的膨胀性能可以增加饱腹感，减少食物的摄入量，从而控制体重[15]，起到减肥和减少糖分摄入的作用。麻竹笋壳IDF 持油力可达7.56 g/g，能够减少过多饱和脂肪酸在人体中的积累，从而降低血脂，对于防治心血管疾病和神经性疾病有积极作用。而麻竹笋壳IDF 具有较好的水化特性和持油力，且显著优于其他品种竹笋或是竹笋壳IDF[4，16]，能更好地增加饱腹感、预防肥胖、降低血糖和血脂、防治糖尿病、心血管疾病和神经性疾病。

2.2 结构分析

2.2.1 扫描电镜分析

采用扫描电子显微镜观察麻竹笋壳IDF 表面特征，结果如图1 所示。

图1 麻竹笋壳IDF 的扫描电镜图像Fig.1 Scanning electron microscopy of IDF from bamboo shoot shells

由图1 可知，膳食纤维孔隙特征与其有效表面特征有关联，麻竹笋壳IDF 具有不规则的片状结构，且表面呈现多褶皱、多间隙，而疏松多孔的结构特征使其可以更加容易吸附如水和葡萄糖等小分子颗粒，展示出了其在水合特性上的优势。相比于可溶性膳食纤维，IDF 具有更大的表面积和更加不规则表面[4]，所以在功能特性方面，IDF 更为突出。同时IDF 表面有球形物质，可能是蛋白质或淀粉颗粒。

2.2.2 傅里叶红外光谱分析

麻竹笋壳IDF 的红外光谱如图2 所示。

图2 麻竹笋壳IDF 的红外光谱Fig.2 Infrared spectra of IDF from bamboo shoot shells

由图2 可知，IDF 主要由纤维素、半纤维素、木质素组成。3 408.74、2 921.47、1 635.40 cm-1分别代表O—H、亚甲基C—H 伸缩振动和C O 结合水峰，这3 个峰是纤维素和半纤维素分子内或分子间的特征峰。1 635.40 cm-1和1 428.35 cm-1处的吸收峰分别为木质素苯环和纤维素，为C C 伸缩振动。1 200～1 000 cm-1是多糖的分子指纹区，红外光谱在此范围内存在多个吸收峰，为吡喃环的伸缩振动[9]，说明麻竹笋壳IDF 为吡喃糖。此外，897.68 cm-1和782.10 cm-1处的吸收峰说明麻竹笋IDF 存在α 型糖苷键。

2.2.3 分子量分析

多糖分子质量会影响其生物活性，当其分子质量过大时，可能直接导致其无法进入细胞，而分子质量过小又会使其几乎丧失生物活性。采用高效液相凝胶渗透色谱法检测样品的分子量。以分子量对数对保留时间（t）绘制标准曲线，得线性回归方程：y=-0.188 4t+12.074，R2=0.993 3。麻竹笋壳IDF 在相同条件下进行分子质量测定，发现其有两种分子量的多糖，保留时间分别为42.677、44.209 min，代入回归方程并计算其相对分子质量分别为10 154、5 224 Da，说明IDF 是分子量不同的杂多糖，这也可能是提取方式不同造成的[17]。

2.2.4 单糖组成分析

根据离子色谱检测各单糖标准品保留时间，将样品的离子色谱图与单糖标准品的保留时间进行对照。表2 为麻竹笋壳中IDF 的单糖的组成和含量。

表2 麻竹笋壳IDF 中单糖含量Table 2 Monosaccharide content in IDF from bamboo shoot shells

由表2 可知，样品中共检测出阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖等8 种单糖，其中木糖含量最高，其次为阿拉伯糖和葡萄糖，分别占62.70%、15.63%、14.46%，说明IDF 中半纤维素含量较高，这与其他果蔬提取IDF 结果类似[18]。半乳糖醛酸含量很低，说明果胶类可溶性物质极少。

2.3 功能特性分析

2.3.1 胆固醇吸附力

膳食纤维能够通过吸附胆汁酸，一定程度上抑制肠道对胆汁酸的吸收，降低人体肝内胆汁酸含量，间接加速分解体内的胆固醇，从而有效降低人体血清和肝内胆固醇含量，最终能够防止冠心病及心血管疾病的发生。麻竹笋壳IDF 功能特性见表3。

表3 麻竹笋壳IDF 功能特性Table 3 Functional properties of IDF from bamboo shoot shells

由表3 可知，麻竹笋壳IDF 在pH7 时的胆固醇吸附能力（7.76 mg/g）强于在pH2 时（6.21 mg/g），表明膳食纤维在小肠环境中结合胆固醇的能力比在胃液中的效果更佳。其较强的吸附能力能使体内的大量胆汁酸被排出体外，从而促进胆固醇的消耗增加，以达到降低胆固醇、胆汁酸含量的目的，这也是预防胆结石的一个途径[18]。

2.3.2 葡萄糖吸附能力

由表3 可知，麻竹笋壳IDF 对葡萄糖的吸附量为0.148 8 mg/g。膳食纤维可以通过吸附葡萄糖降低血糖含量，从而在一定程度上降低葡萄糖在人体内的吸收速率，可以缓解糖尿病症状。而麻竹笋壳IDF 由于其表面多皱褶、疏松多孔的结构特征，使其拥有较强的葡萄糖吸附能力，体内多余的葡萄糖被其截留，并随着消化排出体外，从而达到降低血糖的作用。

2.3.3 α-淀粉酶抑制能力

碳水化合物要经体内消化酶水解生成单糖后，才能被体内的小肠吸收，与血糖水平有密切联系。而膳食纤维的α-淀粉酶抑制能力可以降低α-淀粉酶活性，从而降低碳水化合物转化为葡萄糖的速度，达到降血糖的作用。由表3 可知，麻竹笋壳IDF 的α-淀粉酶抑制能力可达86.98%，其优于玉木耳IDF 的α-淀粉酶抑制能力（45.43%）。α-淀粉酶抑制能力在控制餐后高血糖治疗中具有关键作用，而合成的α-淀粉酶抑制剂会给人体带来不良的副作用[19]，因此人们会更倾向于在膳食中寻找天然的更健康的具有α-淀粉酶抑制能力的食品，麻竹笋壳具有良好的α-淀粉酶抑制能力，是一种潜在待开发的资源。

2.3.4 结合多酚和黄酮含量

研究发现，多酚类化合物和黄酮类化合物作为物质中的主要抗氧化物质，具有抗氧化、抗癌、抗菌和预防心脑血管疾病等多种功效。由表3 可知，麻竹笋壳IDF 结合多酚含量（12.86 mg/g） 较高，黄酮含量为0.110 9 mg/g，可用于抗氧化剂的开发研究。

2.4 体外发酵对肠道菌群的影响

将发酵后的样品进行16S rDNA 测序，得到微生物群组成分析结果见图3。图4 为JP、FOS、IDF 体外发酵液中门水平肠道菌群组成热图。

图3 体外发酵24 h 肠道菌群在纲水平上的组成分析Fig.3 Intestinal flora composition at the class level after in vitro fermentation for 24 h

图4 相对丰度TOP 30 群落组成丰度聚类分析热图Fig.4 Cluster analysis of relative abundance of TOP 30 community composition

不同碳源下健康人粪便中的微生物群相对丰度占比有明显差异。空白组（JP）、低聚果糖组（FOS）、膳食纤维组（IDF）优势菌群种类相似，在纲水平上包括γ-变形菌纲（Gamma-amoeba）、拟杆菌纲（Bacteroidia）、梭菌（Clostridia）、厚壁菌纲（Negativicutes），其中变形菌纲和拟杆菌纲的数量占比较高，分别占人体粪便细菌的60%～80%和10%～20%。IDF 组中Gammaamoeba 相对丰度占比高于JP 组，IDF 在一定程度上促进Gamma-amoeba 生长发育。试验组中Bacteroidia、Clostridia 相对丰度均低于JP 组，IDF 组相对丰度最低。图4 深色区域发生了变化，表明JP、FOS、IDF 的酵解均改变了肠道菌群的组成。发酵24 h 后，拟杆菌属、考拉杆菌属相对丰度增加。研究表明，考拉杆菌能增强胃肠道机能、降低炎症水平[20]。拟杆菌是人体重要的共生菌，有助于人体消化食物以及获得营养和能量[21]。此外，厚壁菌与拟杆菌的比例降低，这与肥胖程度有关[22]，说明IDF 有助于调节人体肠道菌群，影响肥胖调节机制。

3 结论

麻竹笋壳不可溶性膳食纤维具有疏松的结构，有较好的水化特性、持油能力，显著优于其他品种竹笋或竹笋壳IDF。此外具有较高的胆固醇和葡萄糖吸附能力、较好的α-淀粉酶抑制能力，是一种品质较好的膳食纤维，在食品工业中具有广泛的应用前景。麻竹笋不溶性膳食纤维能有效改善肠道菌群种类和丰度，有助于有益菌如拟杆菌、考拉杆菌相对丰度的增加，在控制血糖升高、降脂、控制肥胖等方面具有潜在优势。