一株C型产气荚膜梭菌的分离与鉴定

宋锋，刘赛，荣榕

（山东省滨州市博兴县畜牧兽医服务中心 山东滨州 256600）

产气荚膜梭菌（魏氏梭菌）是一种革兰氏阳性、杆状、可形成芽孢的厌氧菌，产气荚膜梭菌是一种人畜共患病原菌、其特点是在体内或者食物中生长迅速，菌体细胞数量在10 min 内可以翻倍[1]，该菌在生长过程中快速产生有毒气体（如亚硫酸盐），可引起人畜各种组织感染，如污染伤口的气性坏疽，人类胃肠炎（包括食源性和非食源性腹泻），动物的坏死性肠炎（NE），牛、羊和家兔的梭菌病等[2-3]。另外，产气荚膜梭菌是食品加工卫生方面的重要指标，其在周围环境中广泛分布，经常从土壤及动物肠道和粪便中分离出来[4]。其在不适宜生存的恶劣条件下（如缺乏营养、干燥、高温、低温、紫外照射等）可以形成对外界具有较强抗性的芽孢，芽孢作为其生物休眠体具有很强的生存能力，不易被常规消毒剂、高温高压等灭菌条件所杀灭，在环境适宜时，芽孢杆菌可以重新萌发繁殖，具有很强的致病性，往往给畜牧养殖业（猪、牛、羊及家禽等）带来巨大的经济损失[5-6]。近年来产气荚膜梭菌耐药性随着抗菌药物的大量使用逐年增加，许多临床强毒株出现了多重耐药性，给养殖业健康发展和食品安全、人类健康带来了巨大的挑战[7]。

羊梭菌病是由产气荚膜梭菌引起的一种急性、高度致死性疾病，常包括羊快疫、猝狙、肠毒血症、羔羊痢疾、黑疫等，每年因该病对养羊业造成巨大的损失[8-9]。该菌感染羊只后可出现食欲减退、反刍次数减少，进而出现腹胀、腹泻、呼吸困难甚至突然死亡等临床症状，发病羊只剖检变化为心脏、肾脏、肺脏、胃、肠道等多器官水肿、出血等剖检变化。膘情较好的羊只感染产气荚膜梭菌后可出现急性死亡症状，往往没有得到救治的机会，发病动物的病死率30%以上[10]。

本文从山东博兴县某羊场的一只疑似梭菌病患病羊肝脏进行细菌分离，通过对分离菌菌落特征分析、革兰氏染色镜检及产气荚膜梭菌α（CPA）、β（CPB）、ε（ETX）和ι（ITX）四种毒素进行PCR 鉴定，确定该分离菌为羊源C 型产气荚膜梭菌。

1 材料与方法

1.1 材料

1）病料。山东博兴县某羊场中疑似梭菌病患病羊。

2）试剂及仪器。绵羊血平皿及卵黄琼脂基础培养基、药敏纸片为杭州微生物试剂有限公司产品、革兰氏染色试剂从青岛海博生物技术有限公司购买；PCR Mix 为北京百泰克生物技术有限公司产品，DL2000 为AG 公司产品；厌氧培养箱为上海新苗仪器设备制造有限公司设备、细菌基因组提取试剂盒及PCR 扩增试剂购自济南盛伟生物科技有限公司。

1.2 方法

1）细菌的分离培养。取病羊肝脏放于无菌玻璃平皿中，对肝脏表面进行消毒处理、使用无菌手术刀，切开肝脏，使用一次性接种环蘸取肝脏内部病料，划线接种于绵羊血平皿中，将平皿置于42 ℃厌氧培养箱中进行分离培养。

2）细菌表面形态观察。经42 ℃培养24 h 后，将平板取出，观察细菌菌落形态，将分离菌划线卵黄琼脂板上进行厌氧培养后取单菌落进行革兰氏染色镜检。

3）分离菌的PCR 分型鉴定：①细菌基因组的提取。用灭菌的接种环挑取单菌落接种于魏氏梭菌专用液体培养基中，42 ℃条件下厌氧培养24 h，取0.5 mL 培养菌液，经离心沉淀、溶菌酶处理后使用细菌基因组提取试剂盒提取分离菌的核酸，提取核酸存于-40 ℃保存备用；②引物合成。魏氏梭菌的分型及鉴定引物按照文献[11]中序列合成，其中α 毒素基因片段为300 bp 左右、β 毒素部分基因片段约为190 bp、ε 毒素基因片段约为650 bp、ι 毒素截短的基因约为440 bp，所有引物由上海生工科技有限公司合成；③PCR 扩增体系。总体系20 μL：2XPower Taq Master Mix 10 μL、灭菌水6 μL、上下游引物各0.5 μL（20 μM）、模板3 μL。PCR 反应条件：预变性为94 ℃、3 min；变性条件为94 ℃、15 s，退火条件为44 ℃、20 s，延伸条件为72 ℃、30 s，共30 个循环；循环扩增最后在72 ℃延伸6 min；2～8 ℃保存。取PCR 产物5 μL 进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，120V 运行15 min 后观察核酸电泳结果，紫外成像仪拍图片保存。

4）分离菌的药敏试验。将培养菌液稀释后涂板，分别将多西环素、卡那霉素、新霉素、氟苯尼考、环丙沙星、庆大霉素、氨苄西林等药敏片贴在平板上，厌氧培养12～16 h 后观察耐药情况。

5）分离菌外毒素试验。将单菌落接种于魏氏梭菌专用液体培养基中，42 ℃条件下厌氧培养12 h，取2 mL 菌液于灭菌离心管中离心取上清，使用灭菌生理盐水进行5 倍稀释。选取6 只日龄体重相近的小白鼠，3 只作为对照组尾静脉注射0.2 mL 灭菌生理盐水，3只作为实验组尾静脉注射0.2 mL 稀释菌液上清。

2 结果

2.1 细菌的分离

在42 ℃温度下厌氧培养24 h 后在血平板上形成形双层溶血环的菌落，单菌落表观呈现灰色、圆形、略显光滑、微微隆起的双溶血环（图1）。在显微镜下可见革兰氏阳性、杆状粗大杆菌（图2）。挑取单菌落在卵黄琼脂板上，菌落周围呈现圆形、不溶性、不透明白色沉淀物（图3）。

图1 绵羊血平板培养

图2 卵黄琼脂培养

图3 魏氏梭菌镜检

2.2 产气荚膜梭菌的分型PCR 鉴定

PCR 鉴定结果显示在300 bp 和190 bp 位置出现目的片段表明α、β 毒素阳性，ε、ι 毒素、阴性对照无相应条带出现，该扩增结果表明该分离菌为C 型产气荚膜梭菌（图4）。

图4 魏氏梭菌分型

2.3 药敏试验

药敏试验表明分离菌对常见抗生素具有不同程度的耐药性，对头孢噻呋敏感性最高，对氨苄西林中敏，对多西环素、卡那霉素、新霉素、氟苯尼考、环丙沙星、庆大霉素耐药。

2.4 外毒素试验结果

实验组三只小鼠在攻毒后1 h 出现精神沉郁、行动迟缓、呼吸加快现象，3 h 后全部死亡，对照组小鼠状态正常，全部存活。

3 讨论

产气荚膜梭菌是条件性致病菌，致病能力主要依靠其外毒素，相关研究显示其外毒素主要有α、β、ε、ι、γ、δ、θ、η、κ、λ、μ、υ 等12种，根据其致病力较强的主要的前四种外毒素可将产气荚膜梭菌分为A（α）、B（α、β、ε）、C（α、β）、D（α、ε）、E（α、ι）等五种基因型。A型产气荚膜梭菌产量最高的α 毒素为所有基因型均含有的毒素，其具有细胞毒性，可导致血管渗透性增加，出现皮肤坏死、血小板凝集，使动物发生坏死性肠炎等症状；B 型可产生β 毒素，β 毒素可分为β1、β2 毒素，β1 毒素是一种具有细胞毒性和致死性的强毒素，β2 毒素是最近几年相关学者从C 型产气荚膜梭菌发现的新毒素，与β1 毒素相似。B 型和D 型产气荚膜梭菌感染易引起牛、羊的肠炎或肠毒血症，当前E 型导致的临床致病案例较少[12-14]。在最新的研究中又有新的基因型被添加到这个分型系统中，包括产气荚膜梭菌的F 型和G 型[15-16]。

产气荚膜梭菌的毒素可引起人类和动物不同的肠道疾病，这些疾病是由产气荚膜梭菌的一种或多种毒素介导的，在与产气荚膜梭菌相关的肠道感染中，C 型菌株引起人和动物的感染，其可引起羊猝狙，该病的主要特征为急性死亡、会导致腹膜炎和溃疡性肠炎的一种毒血症，急性腹痛，粪便中带血。该病的发生与采食C 型产气荚膜梭菌污染的饲料或饮水有关，多发生在1～2 岁的成年绵羊或山羊，呈现出明显的地方性流行趋势，常在冬春季节的低洼、潮湿地区发生。细菌进入肠道后在小肠大量繁殖，迅速产生并释放毒素，引起羊只发病。发病羊症状多出现机体消瘦、跟不上羊群、时常卧地不起、精神烦躁、昏迷或痉挛等，病程短促常于数小时内死亡[17]。

产气荚膜梭菌普遍存在于环境中，是肠道微生物群的正常成员，当突然改变饮食、抗生素过度治疗或天气突然变化时，导致动物受到应激，免疫抵抗力下降，肠道微生物菌群平衡失调，产气荚膜会快速生长，大量产气和分泌多种肠毒素，短时间内可导致羊只死亡。同时，该菌能产生广泛的胞外毒素和水解酶，在有氧环境中有一定的存活数量。加强环境消毒、异地运输过程中提前应用一些抗应激物、定期饲喂一些中药制剂和按时免疫羊三联四防疫苗，可以较为有效的预防羊梭菌病的发生，降低梭菌病对养羊业造成的经济损失。■