澳洲坚果油脂对脂多糖诱导小鼠肠道损伤的改善作用研究

缪福俊, 单春兰, 耿树香, 宁德鲁, 郭刚军

(云南省林业和草原科学院1,昆明 650201)

(贵州大学动物科学学院2,贵阳 550025)

(云南省热带作物科学研究所3,景洪 666100)

肠道是机体营养消化与吸收的最大场所,炎症性肠病已成为全球性疾病,与肠道黏膜免疫、氧化应激、炎性因子等变化密切相关[1-3]。Toll样受体(TLRs)是肠上皮细胞、免疫系统和微生物之间的媒介,可通过调节黏膜免疫、炎症、稳态、肠道菌群等方面参与炎症性肠病的发生[4,5]。脂多糖(LPS)是诱发机体炎症反应的经典药物,也是Toll样受体4(TLR4)重要配体之一[6,7]。LPS/TLR4信号通路是机体免疫系统中的重要炎症通路之一,其中TLR4/细胞核转录因子(NF-κB)通路已成为研究许多抗炎药物,包括天然化合物的经典信号通路和药理靶点[8,9]。

近年来,食用富含油酸的油茶、油橄榄等油脂对肠道产生的多种药理功效不断被研究报道,不仅可以改善肠道的营养状况,还可以通过调节肠道菌群、增强肠道黏膜屏障及直接抗炎作用来改善肠道病理[10,11]。此外,棕榈油酸被证明是一种具有抗炎、预防动脉粥样硬化、改善代谢综合征、改善胰岛素敏感性等多种生物功能活性的脂因子,它是一种Omega-7脂肪酸,来源常见于深海鱼类或海藻中[12,13]。澳洲坚果油是一个很好的油酸和棕榈油酸来源。

澳洲坚果(Macadamiaintegrifolia)是山龙眼科澳洲坚果属植物,为世界著名坚果。澳洲坚果是我国重要的木本油料之一,种植面积已跃居世界第一位,主要种植区域为云南、广西、广东、贵州等省份[14,15]。澳洲坚果具有极高的经济价值和营养价值,其果仁营养丰富,含有质量分数70%～90%油脂[16]。澳洲坚果油由饱和脂肪酸(硬脂酸、棕榈酸、肉豆蔻酸等)和不饱和脂肪酸(油酸、棕榈油酸、亚油酸等)组成,以油酸(质量分数60%～65%)和棕榈油酸(质量分数15%～20%)为主。此外,澳洲坚果油(MO)中还含有多种药理活性成分,如α-生育酚、β-谷甾醇、多酚类物质、角鲨烯等[17-19]。

因此,澳洲坚果油是研究机体肠道益生功能的极好来源。然而,澳洲坚果油对炎症性肠病是否具有改善作用尚不清楚。探究澳洲坚果油对小鼠肠道损伤的改善作用及其机理,可为机体肠道健康和疾病的预防治疗提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

澳洲坚果仁;24只昆明种雄性小鼠平均体质量为(22±2)g,许可证号SCXK(滇)K2015-0002;普通维持饲料[许可证号SCXK(京)2018-06073];T-AOC、SOD、GSH-Px和MDA试剂盒,Trizol、cDNA反转录、SYBR Green试剂盒, TNF-α和IL-6 ELISA检测试剂盒。

6YY-280全自动液压榨油机,BECKMAN Allegra 64R超速冷冻离心机,BIOTEK ELx800TM酶标仪,LEICA RM2135石蜡切片机,OLYMPUS BX43F正置显微镜,BIO-RAD CFX96Touch荧光定量PCR仪。

1.2 实验方法

1.2.1 澳洲坚果油脂肪酸组成

澳洲坚果仁在云南省木本油料工程研究中心经液压榨油机压榨获得,其脂肪酸组成信息为:棕榈油酸(C16∶1)质量分数16.75%、棕榈酸C16∶0质量分数8.17%,油酸(C18∶1)质量分数62.66%,硬脂酸(C18∶0)质量分数3.33%,亚油酸(C18∶2)质量分数1.47%[17]。

1.2.2 动物分组与给药

小鼠饲养条件[SYXK(滇)K2018-0008]:12 h日光灯明暗交替循环,自由进食和饮水,温度为(25±2) ℃,湿度为(40±5)%。将小鼠适应性喂养1周后,随机分为4组:对照组(CON)、澳洲坚果油组(MO)、LPS模型组(LPS)和LPS+MO组,每组6只。MO组和LPS+MO组连续灌胃澳洲坚果油[2.5 mL/(kg·d)]2周,灌胃后常规饲养,动物自由食水。第15天,LPS组和LPS+MO组通过腹腔注射LPS(5 mg/kg,溶于无菌生理盐水)造成急性肠道损伤[7]。CON组和MO组腹腔注射无菌生理盐水(10 μL/g)。注射6 h 后,脱臼处死并快速取出肠道组织。实验动物伦理审批号EAE-GZU-2022-E021。

1.2.3 肠道组织病理的检查

截取各处理组小鼠空肠组织(接近十二指肠端)1～2 cm于4%多聚甲醛固定48 h,经酒精脱水和石蜡包埋后进行切片(5 μm)。经苏木精-伊红(H&E)染色,中性树胶封片后于光学显微镜下观察。

1.2.4 肠道组织抗氧化指标检测

称取各处理组小鼠空肠组织0.5 g,于玻璃匀浆管内,加入4.5 mL生理盐水,研磨至组织匀浆化,得到质量分数10%的肝匀浆。根据总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)检测试剂盒(南京建成生物有限公司)说明书检测肠道组织中的含量。

1.2.5 肠道组织TLR4和NF-κB mRNA相对表达检测

根据TLR4和NF-κB基因设计引物(北京擎科生物公司合成),引物序列见表1所示。根据RNA提取和cDNA反转录试剂盒对各处理组空肠组织进行RNA提取和cDNA转录。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测各组空肠组织中TLR4和NF-κB mRNA相对表达量。选用β-actin基因作为内参基因。反应体系:引物各1 μL、SYBR Mix 10 μL、cDNA模版2 μL、ddH2O 6 μL;反应条件:95 ℃预变性60 s,(95 ℃变性5 s、Tm退火20 s、72延伸30 s,35×循环)。

表1 目的基因的引物设计

1.2.6 肠道组织NF-κB蛋白表达检测

采用免疫组化(IHC)方法检测各处理组小鼠空肠组织中NF-κB蛋白表达水平。对空肠组织进行石蜡包埋和切片。采用二甲苯溶液进行脱蜡、乙醇复水、柠檬酸抗原液修复、过氧化氢酶孵育,加入NF-κB抗体(1∶400),37 ℃孵育1 h。加入50 μL DAB试剂显色3～5 min。苏木素复染10 min后,进行梯度乙醇脱水,二甲苯透明。采用中性树胶封片,于光学显微镜观察并采集图像。

1.2.7 肠道组织TNF-α和IL-6含量检测

分别称取各处理组小鼠空肠组织1.0 g,采用生理盐水制备成质量分数10%组织匀浆。按照ELISA检测试剂盒操作步骤分别进行肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL-6)含量检测。依次加入100 μL TNF-α或IL-6抗体(37 ℃,60 min),再加入100 μL HRP工作液(37 ℃,30 min),最后加入90 μL显色剂(37 ℃,15 min),在450 nm处测OD值。

1.2.8 统计与分析

采用SPSS 23.0软件和Graphpad Prism 8.0进行统计分析和制图。多组间分析采用Duncan法进行比较检验,用平均数±标准差来表示。P<0.05表示差异显著,P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 澳洲坚果油对肠道病理的影响

腹腔注射LPS可短时间内引起小鼠小肠急性损伤:肠绒毛破裂、上皮脱落、水肿、炎性细胞浸润等[7]。首先,对各处理组小鼠空肠组织进行H&E染色,观察病理变化情况(图1)。CON组和MO组小鼠肠道无组织学病变,绒毛结构完整。LPS组小鼠肠道绒毛断裂,上皮细胞脱落,固有层炎性细胞浸润。LPS+MO组小鼠肠道损伤较轻,炎性细胞浸润减少,肠绒毛恢复。表明澳洲坚果油能改善LPS诱导的小鼠肠道病理变化。

图1 小鼠空肠组织病理结构(H&E染色,400×)

2.2 澳洲坚果油对肠道氧化水平的影响

当LPS进入肠道后,会引起氧化应激,降低肠道的抗氧化能力[20]。生物机体中评价抗氧化能力时,T-AOC、SOD和GSH-Px、MDA等是评价机体抗氧化水平的主要检测指标。由图2可见,与CON组相比,MO组空肠组织T-AOC、SOD和GSH-Px水平显著增高(P<0.05或P<0.01),MDA含量显著降低(P<0.05);LPS组空肠组织T-AOC、SOD和GSH-Px水平极显著下降(P<0.01),而MDA含量极显著升高(P<0.01)。与LPS组相比,LPS+MO组T-AOC、SOD和GSH-Px的水平极显著上升(P<0.01),而MDA含量极显著降低(P<0.01)。表明澳洲坚果油具有显著抗氧化作用,并且能提高LPS诱导炎症空肠的抗氧化能力。郭刚军等[17]研究表明澳洲坚果油对羟基自由基和超氧阴离子自由基具有较强的清除能力,具有一定的清除2,2′-连氮基-双-(3-乙基苯并二氢噻唑啉-6-磺酸)二铵盐自由基的能力与还原力。广泛的证据表明澳洲坚果油中的微量活性成分(多酚类物质、β-谷甾醇、角鲨烯等)具有抗炎和抗氧化作用[21,22]。

2.3 澳洲坚果油对肠道TLR4和NF-κB m RNA转录水平的影响

TLR4/NF-κB通路在LPS诱导的肠道损伤模型中起关键调控作用,当TLR4和LPS结合后,活化NF-κB炎性通路,诱导促炎因子的表达及分泌,进而加剧炎症的病理症状[18]。采用qRT-PCR检测了各处理组小鼠空肠组织中TLR4和NF-κB mRNA转录水平,结果如图3所示。与CON组相比,MO组TLR4和NF-κB mRNA的转录水平无显著差异(P>0.05)。LPS处理后能极显著上调TLR4和NF-κB m RNA的转录水平(P<0.01)。与LPS组相比,LPS+MO组空肠组织中TLR4和NF-κB mRNA的转录水平极显著下调(P<0.01)。澳洲坚果油可以抑制LPS诱导的空肠组织TLR4/NF-κB通路活化,可能与富含的油酸和棕榈油酸相关。赵晓等[11]研究表明富含高油酸的橄榄油可通过抑制LPS诱导的小鼠肠道TLR4通路相关因子表达,减少促炎细胞因子(TNF-α和IL-6)释放。Souza等[23]研究表明棕榈油酸可通过下调TNF-α诱导的内皮细胞中NF-κB、单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、IL-6和环氧合酶(COX-2)基因的表达发挥抗炎作用。Tsai等[24]研究表明棕榈油酸可通过抑制TLR4信号通路改善LPS诱导小鼠巨噬细胞的炎症反应,棕榈油酸对改善炎症的机理值得进一步研究。

图3 小鼠空肠组织中TLR4(a)和NF-κB(b)mRNA相对表达水平

2.4 澳洲坚果油对肠道NF-κB蛋白表达的影响

进一步采用免疫组化方法验证了小鼠空肠组织中NF-κB蛋白表达水平,结果如图4所示。MO组与CON组相比,无显著差异(P>0.05)。与Con组相比,LPS组NF-κB蛋白水平极显著增高(P<0.01)。与LPS相比,LPS+MO组NF-κB蛋白表达水平极显著下降(P<0.01)。提示澳洲坚果油可以抑制LPS诱导的空肠组织中NF-κB蛋白的表达。

图4 小鼠空肠组织中NF-κB免疫组化(a, 400×)和蛋白表达(b)

2.5 澳洲坚果油对肠道炎性因子表达水平的影响

TNF-α和IL-6作为TLR4/NF-κB通路中最初产生的促炎细胞因子,也是该信号通路中主要检测两个炎症因子,在机体中会降低肠道黏膜的屏障功能,加剧肠道炎症反应[25]。采用ELISA检测了各处理组小鼠肠道组织中促炎因子TNF-α和IL-6的表达水平,结果如图5所示。与CON组相比,MO组中IL-6含量显著下调(P<0.05),TNF-α无显著差异(P>0.05)。与Con组相比,LPS组TNF-α和IL-6含量极显著升高(P<0.01)。与LPS相比,LPS+MO组TNF-α和IL-6含量极显著下降(P<0.01)。表明澳洲坚果油可以降低肠道炎性因子水平。

图5 小鼠空肠组织中TNF-α(a)和IL-6(b)表达水平

3 结论

以LPS诱导的小鼠肠道急性损伤为模型,探讨了澳洲坚果油是否通过TLR4/NF-κB通路改善肠道损伤病理。澳洲坚果油可以通过提高抗氧化酶活性和抑制TLR4/NF-κB通路中相关基因和蛋白的表达水平减轻LPS诱导的急性肠道损伤。澳洲坚果油在肠道抗炎方面具有积极作用,可能与其富含的油酸和棕榈油酸密切相关。然而,具体的抗炎机制需要进一步研究加以证实。