油橄榄叶抗氧化活性成分及其作用机制研究进展

李 婷, 张程程, 吴文俊, 章检明, 牛海月, 刘大群

(浙江农林大学食品与健康学院1,杭州 311300)

(浙江省农业科学院食品科学研究所;农业农村部蔬菜采后保鲜与加工重点实验室(部省共建)2,杭州 310021)

(甘肃省林业科学研究院油橄榄工程技术研究中心3,兰州 730020)

油橄榄(OleaeuropaeaL.)主要分布于西班牙、希腊、意大利等地中海国家。我国于1964年开始引种油橄榄,经过多年发展,现已形成了种植总面积超8万hm2的新型特色产业[1]。油橄榄叶是油橄榄种植和橄榄油加工过程中产生的副产物之一。据统计,油橄榄产业每年产生超100万t的油橄榄叶废弃物,但大多数油橄榄叶副产物并没有得到充分利用,通常被丢弃或焚烧,造成了资源的浪费和环境破坏[2]。油橄榄叶是一种丰富而又低廉的可再生资源,不仅是多酚类物质和其他抗氧化活性成分的潜在来源,还具有广泛的健康益处,如抗氧化、抗高血压、抗菌、降血糖、降血脂和抗衰老作用[3]。因此,油橄榄叶资源的再利用尤为重要,将其高附加值的提取物应用于农业食品、保健品、化妆品、生物医药等领域具有广阔的前景。

抗氧化特性与降血糖、降血脂和抗衰老等生物活性密切相关。植物多酚是一类强抗氧化剂,油橄榄叶中富含的橄榄苦苷、羟基酪醇和木犀草素等多酚类物质是其抗氧化活性的重要来源[4]。近年来,随着油橄榄副产物应用价值的不断开发,油橄榄叶的抗氧化特性越来越受关注。尽管目前的研究已证实油橄榄叶提取物中含有丰富的抗氧化活性成分,但是关于其抗氧化成分的提取鉴定及其抗氧化机制的研究较少且不全面。此外,国内外关于油橄榄叶抗氧化活性评价研究大多集中于化学评价法,细胞模型和动物模型作为新型的抗氧化活性评价方法已被用于多种天然抗氧化剂的活性研究,但其在油橄榄叶抗氧化活性评价中的应用却很少报道。研究总结分析了近年国内外相关文献,全面综述了油橄榄叶活性成分的分类、提取工艺、抗氧化能力及其机制,并对油橄榄叶提取物应用的未来发展方向进行了展望,以期为油橄榄叶资源的综合利用及其高附加值的实现提供参考。

1 油橄榄叶活性成分的提取工艺

多酚类物质是油橄榄叶最重要的抗氧化活性成分之一,目前国内外报道的油橄榄叶活性成分提取工艺大多以此为目标。总结了近年来关于油橄榄叶活性成分的提取工艺并比较了不同提取工艺的优缺点。如表1所示,油橄榄叶多酚的提取工艺主要包括传统的溶剂提取法以及辅助提取法、超临界流体萃取等新型提取技术。油橄榄叶活性成分的传统提取工艺主要采用有机溶剂浸提法,使用的溶剂主要为:甲醇、丙酮、乙酸乙酯、乙醇等。Kashaninejad等[5]学者考察了不同体积分数的有机溶剂对油橄榄叶多酚提取率的影响,结果表明体积分数50%乙醇是提取油橄榄叶多酚的最佳溶剂。近年来,为解决有机溶剂浸提法所产生的污染环境、毒性大等问题,低共熔溶剂作为新兴的绿色溶剂被应用于植物成分的提取。ÜnLü[6]以总多酚得率和总黄酮得率为目标,筛选得到了最佳低共熔溶剂组成为氯化胆碱-果糖-水(5∶2∶5)。尽管有机溶剂提取法存在提取时间长、提取效率低等缺点,但因操作方便、设备简单,目前仍是油橄榄叶多酚的主要提取方法。

表1 油橄榄叶活性成分的提取工艺

为加速活性成分从基质中溶出,国内外学者还开发了多种辅助提取方法用于油橄榄叶多酚类物质制备,包括:超声波辅助提取、微波辅助提取、超声波辅助提取与喷雾干燥结合等方法[7]。辅助提取法不仅可以缩短提取时间,还能提高多酚提取率,但能耗高、成本较昂贵,目前还鲜见应用于大批量油橄榄叶活性物质的提取。此外,多种新型提取技术也被应用于油橄榄叶多酚的提取,如加压液体提取、超临界流体萃取、蒸汽爆破提取、瞬时控制压力降等方法[8]。与传统提取技术相比较,新型提取技术具有多酚提取率高、对多酚的破坏作用小、耗时短等优点,但存在对设备需求复杂、投资成本高、技术参数有待完善等问题,在应用方面还存在一定的局限性。

2 油橄榄叶抗氧化活性成分

油橄榄叶活性成分组成已日渐清晰,其不仅富含黄酮、裂环烯醚萜、羟基肉桂酸、简单酚、三萜酸等多酚类物质,还含有多种亲脂类的抗氧化活性物质,包括角鲨烯、生育酚、植物甾醇、β-胡萝卜素、脂肪酸以及由醛、酮、酯、醇、烯烃和烷烃等复杂混合物组成的精油等[19, 20]。尽管油橄榄叶含有大量上述活性物质,但国内外的研究多集中在橄榄苦苷、羟基酪醇、木犀草素、芹菜素等多酚类物质上,这些化学成分决定了油橄榄叶的营养价值和作用活性[21]。油橄榄叶中多酚类物质的质量分数在15～70 mg/g鲜叶之间,其含量与油橄榄品种、采样期、气候条件、生长条件等因素密切相关[22, 23]。油橄榄叶中具有抗氧化活性的多酚类物质主要有:黄酮类、裂环烯醚萜类、三萜酸类、羟基肉桂酸类和简单酚。其中,黄酮类化合物大多具有6C-3C-6C的基本骨架,且常有羟基、甲氧基、异戊烯基等取代基;裂环烯醚萜类化合物多具有半缩醛及环戊烷环的结构,主要以C1—OH与糖成苷的形式存在,C7-C8处断键成裂环状态;三萜酸类化合物多为五环三萜类,由三萜苷元与葡萄糖、半乳糖等戊糖类或糖醛酸组成;羟基肉桂酸类化合物是三碳侧链(C6-C3)的芳香化合物,大多具有邻苯二酚结构;简单酚主要是以酚类的的形式存在,其可通过羟基上的游离氢和苯氧基之间形成分子内氢键来清除自由基。本文对油橄榄叶中主要抗氧化活性成分进行了总结,其中部分活性物质的化学结构见图1。

图1 油橄榄叶主要抗氧化活性成分化学结构

2.1 黄酮类化合物

2.2 裂环烯醚萜类化合物

裂环烯醚萜是环戊烷单萜衍生物中的一类化合物,是由环烯醚萜类化合物在C7、C8处裂环而成,在植物体中多以苷元形式存在[27, 28]。在油橄榄叶中含量较高的裂环烯醚萜类化合物有:橄榄苦苷、橄榄苦苷苷元、断氧化马钱子苷、女贞苷等(图1)。橄榄苦苷是油橄榄叶中最具代表性的裂环烯醚萜类化合物,其含量随着油橄榄叶片成熟度的增加而降低[29],是油橄榄叶苦味化合物的主要来源[30]。imat等[31]根据高效液相色谱-PDA-电喷雾质谱检测出油橄榄叶中裂环烯醚萜类化合物质量分数达16.472 mg/g,其中橄榄苦苷还是油橄榄叶中的主要酚类化合物,占总酚质量的40%～50%。Orak等[32]在8种来源于土耳其和一种意大利的油橄榄叶中鉴定了裂环烯醚萜类、苯乙醇类和黄酮类等化合物共12种,其中橄榄苦苷在所有提取物中含量最高,其质量分数为21.0～98.0 mg/g。研究表明,裂环烯醚萜类化合物的高抗氧化能力可能归因于其结构中的邻二羟基结构,橄榄苦苷在体内还会降解为羟基酪醇,从而发挥其抗氧化活性[33]。

2.3 三萜酸类化合物

三萜酸是由30个碳原子(含6个异戊二烯单元)聚合而成的萜类化合物,多数以游离酸或三萜皂苷配基的形式存在于植物中。在油橄榄叶中,含量最丰富的游离三萜酸为齐墩果酸、熊果酸、山楂酸和积雪草酸(图1)[34]。Romero等[35]使用1∶1混合的甲醇和乙醇提取干燥油橄榄果实中的齐墩果酸和山楂酸,结果显示未经NaOH处理的天然黑橄榄果肉中的三萜酸质量分数高达2 000 mg/kg,其中山楂酸的浓度高于齐墩果酸。有研究表明,三萜酸类化合物中含有的活性基团可阻止或减少肝脏脂质过氧化物丙二醛的生成,另外活泼的双键很容易与自由基发生加成反应,减少氧自由基对肝脏的损害[36]。

2.4 羟基肉桂酸类化合物

羟基肉桂酸是由肉桂酸衍生而成的化合物,是植物中分布最广的一类酚酸化合物。油橄榄叶中含有丰富的绿原酸、咖啡酸、阿魏酸等羟基肉桂酸类化合物[37]。Albogami[38]利用高效液相色谱分析显示油橄榄叶提取物中含绿原酸(16.11±1.35)mg/g,占总酚质量的59.4%。Papoti等[39]采用3种溶剂提取7个希腊品种油橄榄叶并进行含量分析,发现提取溶剂对油橄榄叶羟基肉桂酸活性成分含量影响较小,其中乙醇提取物:3～13 mg CAF/g,甲醇提取物:5～11 mg CAF/g,水提物:4～12 mg CAF/g。酚酸类化合物中一般都具有邻苯二酚结构或者羟基邻位存在给电子基团的衍生物,使其具有较高的抗氧化活性。此外,苯环上的α,β-不饱和酸共轭结构可以提高酚酸类化合物的抗氧化活性[40]。

2.5 简单酚

油橄榄叶中还含有大量简单酚类化合物,包括酪醇、羟基酪醇、羟基酪醇 4-O-葡萄糖苷等(图1)。酪醇、羟基酪醇等化合物为橄榄苦苷的降解产物,在油橄榄叶成熟或加工过程中含量增加,具有与橄榄苦苷相似的生物学特性,如抗菌、降血糖、降血脂、降胆固醇、抗氧化和清除自由基等作用[41, 42]。研究表明,羟基酪醇的抗氧化活性机理可能是通过羟基上的游离氢和苯氧基之间形成分子内氢键来清除自由基,从而延迟氧化反应[43]。在来自葡萄牙的特级初榨橄榄油中,9个品种中酪醇质量分数在1.135～5.715 mg/20 g之间,羟基酪醇质量分数在0.651～5.259 mg/20 g之间[44]。冯晗珂等[45]将油橄榄叶提取物经UPLC分离后测定羟基酪醇浓度为238.67 μmol/L。相比较而言,橄榄油中的羟基酪醇比叶片中的更加丰富。羟基酪醇极易氧化,很难人工合成,因此从植物原料中获取羟基酪醇是目前的主要途径。

3 油橄榄叶抗氧化活性研究进展

随着合成抗氧化剂如丁基化羟基茴香醚和二丁基羟基甲苯的毒副作用不断被发现,其在食品、保健品、化妆品等领域中的应用大为受限[46]。植物基抗氧化剂因此受到了极大的关注。油橄榄叶提取物富含黄酮、裂环烯醚萜、羟基酪醇等多种抗氧化活性物质,具有清除氧自由基,抵抗机体氧化应激水平的作用,从而使油橄榄叶表现出对降血脂、抗衰老、预防心血管疾病等有促进作用[21]。因此,油橄榄叶的抗氧化特性是其多种生物活性的基础,研究油橄榄叶抗氧化活性对于提高其综合利用价值具有重要意义。为了更全面地了解油橄榄叶的抗氧化活性,本文分别从体外化学评价法、细胞抗氧化模型和动物模型3个方面对油橄榄叶的抗氧化能力进行综述(表2)。

表2 油橄榄叶提取物抗氧化活性研究现状

3.1 体外化学评价法

大部分油橄榄叶提取物抗氧化活性的研究通常采用体外化学评价法,包括1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基、2,2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基、O2-、·OH清除能力法以及氧化自由基吸收能力法(ORAC)、铁离子还原/抗氧化能力法(FRAP)[15]。化学评价法一般在固定条件下加入一定量的自由基,通过反应后的自由基残存量反映出抗氧化剂的自由基清除能力。Papoti等[39]等研究发现,油橄榄叶乙醇与甲醇提取物均具有强烈的抗氧化活性,且乙醇与甲醇提取物的DPPH自由基清除能力接近,分别为89%～92%和91%～94%的抑制率;Xie等[47]比较了不同品种、不同干燥方式等处理下油橄榄叶提取物的抗氧化能力,其ABTS和DPPH自由基清除活性在61.05～335.5 mg TE/g和42.7～378.2 mg TE/g之间。与其他农业食品副产物相比,如葡萄藤(DPPH:35.3 mg TE/g),覆盆子渣(DPPH:27.45 mg TE/g),麦麸(ABTS:129.50 mg TE/g),油橄榄叶提取物具有优异的抗氧化性能。油橄榄叶抗氧化活性与其酚类化合物如橄榄苦苷、羟基酪醇、黄酮苷元及其衍生物的含量显著相关(相关系数R>0.9)[47]。Benavente-Garcia等[48]对油橄榄叶酚类化合物抗氧化ABTS能力进行测定:芦丁>木犀草素>油橄榄叶粗提物>羟基酪醇>香叶木素>咖啡酸>橄榄苦苷>木犀草素-7-O-葡萄糖苷>芹菜素7-O-葡糖苷。尽管大多数体外化学抗氧化评价研究均证明了油橄榄叶优异的抗氧化性能,但在研究生物体内抗氧化活性方面,体外化学评价方法不够准确充分,一方面它们是在非生理条件下的pH和温度下进行反应,另一方面体内抗氧化活性需要分析体内的生物利用度、吸收和代谢等因素,体外化学评价方法无法分析上述因素,因此不能客观公正的评价待测物抗氧化活性。

3.2 细胞抗氧化模型

细胞模型通常被用于生物活性物质的抗氧化性能评估,经由分析生物活性物质在细胞内吸收、分布和代谢情况,推测生物活性物质在复杂生物系统中的抗氧化机制,较体外化学评价法能得到更有代表性的生物活性物质抗氧化性评估结果。近年来,众多研究者从细胞实验层面探究了油橄榄叶酚类提取物的抗氧化能力。据报道,生物体经外源性电离辐射、缺氧等因素会诱导线粒体产生超氧阴离子、羟自由基、过氧自由基、单线态氧和过氧化氢等活性氧,这些活性氧均具有诱导细胞产生抗氧化应激的能力[49, 50]。机体自身的抗氧化酶,如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、还原型谷胱甘肽能维持机体处于健康的氧化还原状态[51]。一些非酶抗氧化剂,如多酚类物质等天然抗氧化剂都具有保护机体免受氧化损伤的功能。Difonzo等[52]研究发现富含橄榄苦苷的油橄榄叶提取物能够降低支气管上皮NCI-H292细胞中活性氧ROS产生(下降约40%),具有缓解肺部疾病的潜在作用。油橄榄叶提取物还能够保持葡萄糖诱导氧化应激下HepG2细胞的细胞膜完整性,并使细胞内谷胱甘肽浓度和谷胱甘肽s-转移酶活性维持在与非应激细胞相当的水平,有效改善糖诱导的肝细胞的氧化应激[4];含有羟基酪醇、毛蕊花糖苷和木犀草素的组分的油橄榄叶提取物同样能够诱导细胞产生抗氧化应激反应,保护细胞免受H2O2造成的氧化损伤[53]。

3.3 动物模型

大量化学抗氧化和细胞实验在体外层面证明了油橄榄叶抗氧化活性,由表2可知,近年来部分研究者尝试在体内动物模型层面论证在不同的氧化应激条件下,油橄榄叶能否有效控制机体的氧化还原水平。Rouibah等[54]通过建立Wistar大鼠过敏性哮喘的实验模型,分析油橄榄叶的水提取物和富含羟基酪醇的酸水解物提取物对大鼠肺氧化应激因子丙二醛、还原型谷胱甘肽水平的影响,体内研究表明酸水解提取物比水提取物能更好地改善哮喘疾病中的抗氧化状态,与其富含羟基酪醇有关。此外,油橄榄叶提取物可通过阻止自由基的产生或刺激抗氧化防御系统的成分来调节氯菊酯诱导的遗传和氧化损伤,表明油橄榄叶提取物可能是防止农药诱发的致突变性或致癌性的理想候选物[55]。研究表明,油橄榄叶多酚物质可通过激活核因子E2相关因子2的转录、上调过氧化物酶体增殖物激活受体的表达,从而防止机体免受氧化应激损伤[56]。研究显示油橄榄叶提取物在体内外良好的抗氧化特性,且有利于保持机体健康、维持稳态,这对天然抗氧化剂的开发以及相关疾病的防治具有重要意义。

4 油橄榄叶提取物抗氧化机制

4.1 直接清除自由基

油橄榄叶抗氧化作用可能的机制示意图见图2。多酚类物质具有直接清除自由基的能力,其机制是多酚结构中作为氢供体的酚羟基能够将单线态氧还原成低活性的三线态氧,从而减少自由基在机体中的产生。另一方面,酚羟基还能捕捉活性氧自由基,与环境中的氧结合生成醌类结构,进而发挥清除自由基的能力。研究表明,多酚物质的抗氧化能力与其结构密切相关:1)酚羟基数目越多,捕捉活性氧自由基能力越强;2)具有邻二羟基结构能提高多酚类物质的抗氧化活性。油橄榄叶中的橄榄苦苷、羟基酪醇、黄酮类化合物结构中都带有多个酚羟基,其中槲皮素、木犀草素等物质还具有邻二羟基结构,具有强烈的自由基清除能力,在体外实验中可直接清除DPPH·和ABTS·等自由基[48]。

图2 油橄榄叶抗氧化作用可能的机制示意图

4.2 激活抗氧化酶活性

生物体在受到外界刺激时,组织会受到氧化损伤导致ROS在细胞中快速积累,并加速生物体的死亡[60, 61]。在生物体内存在氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)和NAD(P)H醌脱氢酶1(NQO1)等抗氧化酶,能对抗亲电离子和氧化应激反应,在保护机体免受环境压力方面起着重要作用[62]。研究表明,多酚类物质可激活机体抗氧化酶,起到抗氧化功效。Luo等[59]研究了油橄榄叶提取物对机体活性氧ROS水平的影响,采用0.4 mg/mL的油橄榄叶提取物处理暴露于35 ℃热应激下秀丽隐杆线虫48 h,与对照组相比,处理组活性氧ROS水平显著下降了54.15%,MDA含量降低了72.96%,而抗氧化酶CAT、SOD、GSH-Px活性分别增加了10.81%、30.97%和52.23%。表明油橄榄叶提取物可能通过促进体内抗氧化酶的活性清除ROS产生的自由基,提高对热应力的抗性。此外,油橄榄叶羟基酪醇也可通过增加CAT、SOD、GSH-PX和谷胱甘肽还原酶的活性,清除细胞环境中的过氧化物,维持细胞中还原性谷胱甘肽的水平,改善机体抗氧化防御系统[63]。

4.3 相关核因子的激活

近年来,部分研究提出了油橄榄叶活性成分抗氧化途径相关的作用机制,其中研究最多的是基于核因子Nrf2诱导的调节。Nrf2是一种亮氨酸拉链转录因子,为细胞抗氧化应激的关键核转录因子,可作为一种防御反应抵抗外部和内部的刺激。在氧化应激条件下,大量的Nrf2迅速发生核移位,并激活NQO1、微粒体环氧化物水解酶、血红素氧合酶等相关抗氧化酶的表达,提高还原性谷胱甘肽的水平,维持细胞内氧化/抗氧化的平衡[64]。Zrelli等[65]研究表明油橄榄叶中的羟基酪醇可激活血管内皮细胞VECs的Nrf2信号通路,有助于增强细胞内抗氧化防御系统,降低细胞内ROS水平;此外,黄酮类物质也可使细胞核Nrf2表达增加116%,提高Keap1的表达[66]。核转位状态下的Nrf2可以识别启动子中的抗氧化反应元件下游的目标基因血红素氧合酶、NQO1等,激发它们的表达以缓解多种氧化应激反应。油橄榄叶抗氧化活性成分复杂,其酚类物质的组分含量与抗氧化活性密切相关,但其他活性成分如橄榄苦苷、山楂酸等的抗氧化机制还不清晰。此外,油橄榄叶活性成分在体内的吸收、代谢及其与肠道菌群的互作等研究还有待深入阐明。

5 总结与展望

随着合成抗氧化剂毒副作用不断被发现,利用天然抗氧化剂代替合成抗氧化剂已成为新趋势。油橄榄叶作为一种具有优良抗氧化特性的生物废弃物,可作为天然抗氧化剂的原料,具有巨大的经济价值和社会价值。然而,油橄榄叶在我国的加工应用范围较小,研究不够系统全面,鉴于其优良的抗氧化特性,亟需全面深入研究及推广应用。为实现油橄榄叶资源在农业食品、保健品、生物医药等领域的充分应用,今后对于油橄榄叶抗氧化方面的研究还需进行改进:

油橄榄叶抗氧化活性评价有待加强。目前,国内外关于油橄榄叶抗氧化活性评价研究大多集中于化学评价法,不能充分反映其在生物体内的抗氧化活性,未来的研究可以结合细胞模型和动物模型对油橄榄叶抗氧化活性进行更加客观的评价。

油橄榄叶的抗氧化活性机制需深入研究。油橄榄叶抗氧化活性成分复杂,其黄酮、裂环烯醚萜、羟基肉桂酸、简单酚和三萜酸等酚类物质的组分含量与抗氧化活性密切相关,需通过分离纯化方法明确酚类物质的抗氧化能力,并研究不同酚类物质间的协同抗氧化效果。此外,油橄榄叶中特定酚类物质的抗氧化机制,如橄榄苦苷、山楂酸等物质的抗氧化机制还不清晰,亲脂类的抗氧化活性物质对油橄榄叶提取物的抗氧化作用是否有增效作用还不明确,有待进一步的研究探索。

油橄榄叶的加工利用研究有待加强。油橄榄叶富含多酚类物质,加工利用期间易发生降解反应。另外,油橄榄叶富含橄榄苦苷,味苦涩,在食品抗氧化剂应用中要做到既保留其功能活性而不影响食品风味具有一定的挑战。未来的研究可以利用纳米脂质体等材料将油橄榄叶提取物进行包封,掩盖其苦味,提高其在食品体系中的稳定性。在应用方面,目前我国市场上应用油橄榄叶开发的产品较少。基于油橄榄叶良好的抗氧化特性,通过与其他天然原料复配等方法,开发功能食品、化妆品等多元化产品,不仅能提高油橄榄叶的综合利用价值,还能推动我国油橄榄产业的健康可持续发展。