酶抑制法检测有机磷农药残留研究

张挺

（广州城市职业学院，广东 广州 510405）

近年来，食品安全问题已经严重威胁着人类的健康，而果蔬中由于过量使用或滥用农药而导致的农药残留及其急慢性中毒已经引起了社会的高度重视。目前，我国常用的有机磷，氨基甲酸酯类农药如甲胺磷、对硫磷、马拉硫磷、乐果等几十种高毒农药占总农药用量的70%以上。对农药残留的检测方法主要有色谱分析法[1-3]、酶免疫技术[4、5]、生物技术、酶抑制法[6-8]、毛细管区带电泳等方法，但传统方法费时、繁琐、成本高。本文研究的酶制剂抑制法是一种简便、灵敏、快速、成本低廉的检测方法，特别适合现场检测及大批量样品的筛选，尤其适合集体食堂和宾馆、饭店等采购员使用，保证蔬菜食用的安全性。

一、研究方法

（一）实验材料与仪器

1.实验材料

（1）试剂

盐酸、无水乙醇、三羟甲基氨基甲烷、碘化硫代乙酰胆碱、5,5`-二硫双(2-硝基苯甲酸) (DTNB)均为分析纯试剂。

丙酮色谱纯试剂；无水硫酸钠；磷酸盐缓冲溶液（15.0 g 磷酸氢二钾与1.59 g 无水磷酸二氢钾500 mL 蒸馏水溶解）；甲胺磷、毒死蜱均购于国家农药质检中心；农药速测卡，广州天河绿洲生物化学研究中心；农药标准溶液：有机磷农药标准品和丙酮配制成储备液（1000 μg/mL），置于冰箱中；农药标准使用液：水稀释农药标准溶液使浓度分别为1、3、5μg/mL 的使用液，体积1000 mL。

（2）食品材料

乌鱼、黄鳝、草鱼、塘鲺和豆角购于华南农业大学三角市菜市场，底物和显色剂由华南农业大学食品质量与安全实验室提供。

2.实验仪器

6890GC气相色谱仪，美国Aglient公司；HR2838/39捣碎机，PHLIPS 家用电器公司；752 型紫外光栅分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；TDL-5 型低速台式大容量离心机，上海安亭科学仪器厂；LGJ-10N 冷冻干燥机，北京亚星仪科科技有限公司。

（二）检测方法

1.胆碱酯酶制剂的制备及保藏

试验配制0.2 mol/L 的三羟甲基氨基甲烷溶液和0.1mol/L 盐酸溶液，分装于棕色瓶中。用时再将两者按一定比例配成pH 为8.2 的缓冲液作为胆碱酯酶的提取液。

将鱼背肉洗净，取背肉，称量，置于捣碎机中并加一定量的4℃的提取液，捣成匀浆。将匀浆置于离心机中，4000 r/min 离心10 min，取上清液即胆碱酯酶提取液，于冷冻干燥机冷冻干燥成粉，平均分装到6 至8 个离心管中，用锡纸包裹，避光分别放置于-18℃、4℃、干燥器中室温下保藏。

2.底物和显色剂的保藏

将底物溶液和显色剂溶液避光存放并分别置于4℃、干燥器中室温下保藏，通过酶与底物和显色剂的反应，于420 nm 波长下测定其吸光值，根据吸光值的变化反映底物和显色剂的稳定性。

3.酶制剂活力的测定

往装有胆碱酯酶酶粉的离心管中加入4 mL 蒸馏水，取酶液50μL，用2.8 mL Tris-HCl 缓冲液稀释后，加入25μL 75 mmol/L 的碘化硫代乙酰胆碱溶液，然后再加入25μL 20 mmol/L 5,5`-二硫双(2-硝基苯甲酸) 溶液，记录时间，在420 nm 波长下测定吸光值。每隔10 d 测一次不同保藏条件下的酶活力，每个样品测五次，取其平均值。酶活力以胆碱酯酶与底物和显色剂反应5 min 时420 nm 波长下的OD.值表示，酶活力下降百分率公示为：

4.酶制剂测定豆角中有机磷农药

试验称取150.00 g 豆角三份，分别放入体积为1000mL 浓度为1、3、5 μg/mL 的甲胺磷（毒死蜱同）水溶液中，浸泡1 h，捞出沥干，装入保鲜袋中冰箱储存备用。称取预处理豆角样品可食用部分2.00 g，切碎置于小烧杯中，加5 mL 水，浸泡2 min，洗脱液即样液置于烧杯中备用。吸取样液2 mL，加入酶制剂试管中，再加2 mL 蒸馏水，摇匀；加底物，振摇2 min；加显色剂，摇匀，静置5 min；于420 nm 波长下测读反应液在5、8、10 min 的OD.值，并计算抑制率[9、10]。

空白样的测定，取出一根酶管，加入4 mL 蒸馏水，摇匀，加入底物，振摇2 min，再加入显色剂，摇匀，放置5 min，于420 nm 波长测定反应液在5min、8min、10min 的吸光度。

5.气相色谱法检测豆角样品中有机磷农药

样液制备与 “4.酶制剂测定豆角中有机磷农药” 方法相同，测定方法参照文献[11]。色谱柱：DB-1701 14%-氰丙基苯-86%二甲基硅氧烷共聚物型毛细管柱；长度：30 m；内径：0.32 mm；膜厚：0.25μm；载气：N2；进样口温度：250℃；进样方式：脉冲不分流进样，60 mL/min，0.75 min；进样方式：自动；进样体积：1μL；检测器：FPD；温度：250℃；尾吹气：60 mL/min；空气流量：110 mL/min；氢气流量：150 mL/min；炉初始温度：100℃；初始时间：0 min；升温速率：20 ℃/ min；最后温度：230 ℃；保留时间：3 min，即100℃～230 ℃（20℃/ min，保留3 min）。

根据仪器灵敏度配制一系列不同浓度的农药标准溶液。将各浓度的农药标准溶液2μL～5μL分别注入气相色谱仪中，测得不同浓度有机磷农药标准溶液的峰面积，绘制有机磷农药标准曲线。同时取样品溶液2μL～5μL 。分别注入气相色谱仪中，由测得的峰面积从标准曲线上算出相应的农药含量。

6.酶制剂定性检测有机磷农药

测定甲胺磷溶液浓度分别为0.165、0.385、0.540、0.780、2.015、3.015 mg/kg，和毒死蜱溶液浓度分别为0.100、0.140、0.365、0.405、0.585 mg/kg；将上述不同浓度的农药溶液分别加入酶管中，摇匀；加底物，振摇2 min；加显色剂，摇匀，放置；观察在3 min、5 min、8 min 的颜色变化。与空白实验管对照，反应液颜色为黄绿色或黄色，说明酶被有机磷农药抑制，判断为阳性(+)；反应液颜色为紫红色或浅紫红色，说明酶未被有机磷农药抑制，判断为阴性(-)。

7.农药速测卡检测有机磷农药

取3 片农药速测卡，把制备好的样液滴到白色药片上，静置10 min；将速测卡对折，使红色药片与白色药片叠合发生反应[12]，捏3 min；与空白实验对照[13]，酶被有机磷农药抑制 (白色药片不变色或略有浅蓝色) 为阳性(+)，未抑制(白色药片变为天蓝色或与空白对照相同)为阴性(-)。

二、结果与分析

（一）保藏过程中胆碱酯酶的活性变化

制备获得4 种鱼的胆碱酯酶，测定其活力，在0 min～7 min 反应的活性的高低顺序为：乌鱼的胆碱酯酶＞草鱼的胆碱酯酶＞塘鲺的胆碱酯酶＞黄鳝的胆碱酯酶，其中乌鱼的胆碱酯酶和黄鳝的胆碱酯酶与底物和显色剂反应5 min 后趋于平缓（图1），酶活性无多大变化。

图1 冻干前4 种鱼的胆碱酯酶的活性变化

4 种鱼的胆碱酯酶活力在-18℃下保藏20 d，活力在一定程度上有所增加（图2），之后活力下降，至保藏的40 d，活力下降幅度在6.23%～31.34%之间（见表1），其中以黄鳝的胆碱酯酶酶活力下降幅度最低其次是乌鱼，但是乌鱼的胆碱酯酶酶活力较高。

表1 4 种鱼的胆碱酯酶酶活性在保藏中的下降百分比

图2 胆碱酯酶酶制剂于-18℃下保藏过程中活力变化

在不同保藏条件下，对比了黄鳝的胆碱酯酶活力变化，实验表明冷藏和冷冻保藏对酶活力影响较小。冷藏和冷冻保藏条件下，前20 d 内随着保藏时间的延长，胆碱酯酶酶活力的保持较好，且活力测定值比之前高；20 d 之后酶活力逐渐缓慢下降。在室温和干燥器中保藏，前20 d 保藏于干燥器中的胆碱酯酶酶活力变化比室温下保藏的酶活力略高(见表2)。

表2 保存于不同条件下黄鳝胆碱酯酶酶活力的OD.值变化

（二）底物和显色剂保存的稳定性

底物和显色剂于4℃、干燥器和室温下保藏40 d，三种保藏条件下的底物和显色剂的稳定性都有所降低，表现为所测得的胆碱酯酶酶活力不断下降。其中，保藏于4℃下的底物和显色剂的测定酶活力降低15.60%，稳定性最好；干燥器中和室温下保藏下酶活力分别降低25.31%和28.40%（见表3）。

表3 不同保藏条件下底物和显色剂与酶反应的OD.值变化

（三）酶制剂法检测有机磷农药的准确性

通过对比表4 中对浸泡豆角的农药残留酶抑制法分析和表5 中对纯农药的酶抑制法分析的吸光值和抑制率，1μg/mL 甲胺磷浸泡的豆角样品检测的抑制率下降率为11.40%，1μg/mL 毒死蜱浸泡的豆角样品检测的抑制率下降率为15.58%，表明同一农药同一浓度的吸光值随时间延长而增大（抑制率减小）；甲胺磷检测的抑制率下降率为4.50%～11.40%，毒死蜱检测的抑制率下降率为8.70%～15.58%，表明同一农药不同浓度的吸光值随浓度增大而减小（抑制率增大）。通过酶抑制法和气相色谱法测定样品中残留农药的吸光值和抑制率，酶抑制法测定有机磷农药其分析检测结果与国家标准法测定结果相接近，酶抑制法测定农药残留有较高的准确度。

表4 用提纯酶液测定豆角样品中残留农药的吸光值和抑制率

表5 提纯酶液测定豆角样品实际所含纯农药的吸光值和抑制率

（四）酶抑制法定性检查分析

通过酶制剂定性检测有机磷农药和农药速测卡检测有机磷农药的实验方法对检测结果进行判断，结果显示（如表6 所示），本实验检测的灵敏度根据农药种类的不同而不同，实验中甲胺磷的检出限为0.10 mg/kg，毒死蜱的检出限为0.20 mg/kg，范围一般在0.08mg/kg～0.20 mg/kg 之间。而速测卡的检测灵敏度要比酶抑制法的灵敏度低（见表7），甲胺磷的检出限为0.40mg/kg，毒死蜱的检出限为0.40 mg/kg，范围在0.10mg/kg～10 mg/kg 之间。实验表明酶抑制法比速测卡法对有机磷农药残留检测灵敏度高，更为准确。

表6 气相色谱法检测豆角中农药残留结果

表7 酶抑制法和速测卡法灵敏度检测对比（显色判断）

三、结论

本文通过对乌鱼、草鱼、塘鲺和黄鳝4 种鱼肉提取的胆碱酯酶在不同保藏条件下的活力分析，表明该酶制剂在4℃以下冷藏或冻藏其活力保存较稳定，保藏20 d 内酶活力略有升高，保藏30 d 活力下降为6.23%～31.34%；底物和显色剂在4 ℃下保藏对酶抑制法检测结果影响较小。本文中胆碱酯酶抑制法，其检测农残浓度的准确度比气相色谱法测定准确度稍低，对甲胺磷和毒死蜱的检出限分别为0.10 mg/kg 和0.20 mg/kg，对豆角样品农残浓度测定值的绝对误差值在0～0.029 mg/kg，相对误差值在0～17.6%，同种农药抑制率下降值的绝对误差值非常接近，差值仅为0.5%～1.0%；酶抑制法对实验样品的农残检出限为0.2 mg/kg，实验中农药速测卡对甲胺磷和毒死蜱的检出限均为0.40 mg/kg，酶抑制法检测限低，且较为稳定和准确。综上，本文研究的胆碱酯酶抑制法测定有机磷农药残留对实际样品大量筛查检测具有一定借鉴作用。