短时减压处理对冷藏及货架期蓝莓品质的影响

张 琳，徐 帆，吕静祎，2，葛永红，2，米红波，2，陈敬鑫，2

（1.渤海大学 食品科学与工程学院，辽宁锦州 121013；2.生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁锦州 121013）

0 引言

蓝莓具有较高的营养和经济价值，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一，被誉为“浆果之王”［1］。采后蓝莓易出现果实失重、硬度降低、呼吸强度增加和营养成分减少等品质劣变现象［2］。目前，蓝莓果实的保鲜技术主要有低温保鲜、涂膜和气调贮藏等，均可有效保持蓝莓果实的品质和营养价值。然而，蓝莓低温贮藏时易发生冷害；涂膜技术操作复杂，均一性差；气调贮藏时气体浓度不易控制，易诱发生理性病害［3-5］。由此，基于当前产业需求，蓝莓果实采后保鲜技术亟需更新。

近年来，减压技术引起了果蔬采后研究工作者的关注。研究表明，对比气调贮藏，减压贮藏可使果蔬贮藏期延长10%～30%，较低温贮藏延长30%～50%［6］。减压贮藏旨在营造“低压、低温、高湿、换气”环境，可有效抑制呼吸，减缓果蔬新陈代谢，抑制病原菌生长［7］。此外，采后蓝莓果实具有较高的呼吸强度和蒸腾速率，因此其货架期较短［8］。经过低压贮藏的果蔬离开贮藏环境之后，恢复常态和后熟的过程比较缓慢，可有效延长果蔬的货架期［9］。与长期减压贮藏相比，减压处理时间短，可有效提高减压设备利用率，节约运行成本，其后续效应亦可抑制冷藏过程中品质劣变和冷害的发生，延长冷藏保鲜期。

蓝莓果实为营养价值和商品价值较高的浆果代表，且其体积小，易于分装，适用减压贮藏或短时减压处理技术。本文以‘北陆’蓝莓为试验对象，研究2 kPa 减压处理对后续贮藏及货架期间果实品质、香气成分生成及相关抗性酶活性的影响，以期为采后蓝莓果实低压处理的进一步生产应用提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

‘北陆’蓝莓果实采购于锦州市娘娘宫蓝莓采摘园，果实均为九成熟，采收后1 h 内运回实验室，挑选无机械损伤、无病虫害、质地优良、颜色相近、大小均一的果实，置于室温条件［（20±2）℃，湿度45%～47%］待用。

浓盐酸、甲醇，天津致诚化学制品有限公司；氯化钠，2-辛醇（色谱纯，≥99.8%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；无水醋酸钠、聚乙二醇6000、聚乙烯吡络烷酮、Triton X-100、过氧化氢、二硫苏糖醇、L-蛋氨酸、氮蓝四唑、核黄素硼酸、L-苯丙氨酸，北京沃凯生物科技有限公司。以上溶剂均为分析纯（＞99.5%）。

1.2 仪器与设备

H1650R 型台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；PC-3 型真空干燥器（藤原工具有限公司）；JA5003 型电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；PAL-1 型数显糖度计（广州市爱宕科学仪器有限公司）；FE28型pH 计（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；UV-2550 型紫外分光光度计（岛津仪器（苏州）有限公司）；PBI Dansensor 型便携顶空分析仪（丹圣（上海）贸易有限公司）；7890N/5975 型气相色谱-质谱联用仪（安捷伦科技（中国）有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 蓝莓果实处理

将挑选好的蓝莓分装成盒，约125 g/盒，放入聚乙烯袋中，并选取等距4 个点打孔，孔径约为1 cm，以保持85%～95%相对湿度。将蓝莓果实分成3 组：常压（101 kPa）冷藏组（以下简称CK）；12 h 减压预处理组，将蓝莓果实于（2±0.5）kPa 减压处理12 h 后，取出置于常压下冷藏（以下简称LP12h）；24 h 减压预处理组，将蓝莓果实于（2±0.5）kPa 减压处理24 h 后，取出置于常压下冷藏（以下简称LP24h）。预处理温度均为4 ℃。随后进行4 ℃冷藏，分别于第0，7，14，21，28 d 进行取样。同时，模拟货架期2 d，即将冷藏后果实在20 ℃下放置2 d，分别记录为（0+2），（7+2），（14+2），（21+2），（28+2）d。在取样当天测定失重率、呼吸强度和可溶性固形物含量（Soluble Solids Content，SSC）等指标。同时，将样品经液氮冷冻后保存于-80 ℃超低温冰箱中，以用于后续试验。每个指标均做3 次以上生物学重复。

1.3.2 腐烂率和失重率

腐烂率测定采用计数法［10］。随机取3 盒蓝莓果实，以表面有霉菌、破裂和流水等现象记为腐烂，计算公式如下：

式中 W——腐烂率；

Nx——腐烂果数量；

N0——总果数量。

失重率测定采用称量法。随机取3 盒蓝莓果实，计算公式如下：

式中 X——失重率；

m0——样品的初始质量，g；

mx——贮藏第x 天时样品的质量，g。

1.3.3 呼吸强度

参照SILVA 等［11］的方法并做部分修改。随机选取30 个果实，随机分为3 组，分别置于容量为250 mL 玻璃烧杯内密封，于20 ℃条件下放置2 h 后，用50 mL 注射器将烧杯内气体匀速抽送5次，使杯内气体混合均匀。用顶空分析仪测定每个烧杯内的CO2含量。计算公式如下：

式中 H——呼吸强度，mg CO2/（kg·h）；

φ—— 密闭空间中CO2的体积分数，%；

V——玻璃烧杯中密闭空间体积，mL；

1.96—— CO2的摩尔质量与摩尔体积之比（44/22.4，按标准状况下计算）；

m——蓝莓质量，kg；

t——放置时间，h。

1.3.4 可溶性固形物含量

取20 个蓝莓果实，在研钵中研磨成匀浆，于4 000 r/min 条件下离心作用10 min，取上清液用数显糖度计测定，以质量分数（%）表示。

1.3.5 总酚和类黄酮含量

参照曹建康等［12］方法，略有改动。称取2.00 g果肉，加入少许1% HCl-甲醇溶液研磨成匀浆后，转移至20 mL 刻度试管定容。于4 ℃条件下避光提取20 min，加活性炭；再于4 ℃，12 000 r/min 离心作用至脱色，收集上清液。以1% HCl-甲醇溶液作为对照，用紫外分光光度计分别在波长280，325 nm 处测定样品的吸光度。以没食子酸和芦丁制作标准曲线，分别以其当量计算总酚和类黄酮含量，单位为mg/g。

1.3.6 香气成分

参考LI 等［13］的方法并做部分修改。将冷冻的蓝莓果实研磨至均匀粉末状。称取3.00 g 粉末状样品置于20 mL 样品瓶中，加入3 mL 饱和氯化钠溶液，再加入1 µL 2-辛醇水溶液（0.812 g/L）作为内标，迅速盖上盖子并用封口膜密封。每个样品进行3 次重复试验。

果实香气物质的收集采用固相微萃取法。使用前，将萃取头（50/30 µm，PDMS/CAR/DVB，Supelco）进行250 ℃老化30 min。将样品瓶置于磁力搅拌器上，于50 ℃，600 r/min 转速条件下平衡15 min；然后将萃取头插进样品瓶的顶空部位，推出石英纤维距液面1～2 cm 处，萃取30 min。萃取结束后，迅速插入到气相色谱-质谱联用仪进行分析。

蓝莓果实挥发性成分分析的气相色谱条件：色谱柱为HP-5MS 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25µm）；氦气作为载气，流速为1.0 mL/min，不分流模式进样；进样口温度250 ℃，解析5 min。升温条件参照LI 等［13］的方法并进行优化，初始柱温为40 ℃，保持3 min；以3 ℃/min 的速率上升至120 ℃并保持2 min；最后以8 ℃/min 的速率上升至230 ℃并维持4 min，总运行时间为49.4 min。

质谱条件参考张强等［14］的方法。界面温度为280 ℃，离子源温度为230 ℃，质谱检测器为EI 模式，电压为70 eV，四极杆温度为150 ℃，质谱检测范围为m/z 30～550 amu。采集到的质谱图通过检索NIST11 标准质谱库（NIST Chemistry WebBook.）与标准图谱比对，根据得到的检索信息以及匹配度评分确定香气物质。

1.3.7 抗性酶活性分析

（1）超氧化物歧化酶

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性测定参照GE 等［15］的方法并修改。称取1.00 g 蓝莓果肉，加入10 mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液（pH=7.8），在冰浴条件迅速研磨成匀浆，于4 ℃条件下12 000 r/min 离心作用30 min，取上清液待测定。酶活性测定：合并上清液（0.3 mL）、磷酸缓冲液（1.5 mL，50 mmol/L）、乙二胺四乙酸二钠（0.3 mL，0.1 mmol/L）、氮蓝四唑（nitro-blue tetrazolium，NBT）（0.3 mL，0.75 mmol/L）、甲硫氨酸（0.3 mL，130 mmol/L）和核黄素（0.3 mL，20 µmol/L），混匀后于4 000 lux 日光灯下反应15 min，放置暗处反应 15 min，于560 nm 处测定吸光度（OD）值。SOD 的一个活性单位（U）定义为每分钟每克鲜重组织的反应体系对NBT 光化还原50%的抑制。

（2）过氧化氢酶

过氧化氢酶（catalase，CAT）活性测定参照LI等［16］的方法。称取1.00 g 蓝莓果肉，加入10 mL的提取缓冲液（含有5.0 mmol/L 二硫苏糖醇和2.0%交联聚乙烯吡咯烷酮），在冰浴下研磨成匀浆，于4 ℃，12 000 r/min 离心作用30 min，收集上清液，低温保存备用。

向2.9 mL 20 mmol/L H2O2溶液中加入100 µL酶液，每隔30 s 于240 nm 处测定OD 值，持续2 min，以蒸馏水为参比调零。以每分钟吸光值变化0.01 为一个酶活力单位（U），CAT 活性以U/g表示。

（3）多酚氧化酶

多酚氧化酶（polyphenol oxidas，PPO）活性测定采用比色法，参照曹建康等［12］的方法。称取1.00 g 蓝莓果肉，加入10 mL 的提取缓冲液（含有1 mmol 聚乙二醇单甲基醚、4%交联聚乙烯吡咯烷酮和1%曲拉通X-100），在冰浴中研磨成匀浆，于4 ℃，12 000 r/min 离心作用30 min，收集上清液，低温保存备用。

取1 只试管，加入2.5 mL 50 mmol/L 乙酸-乙酸钠缓冲溶液和1.0 mL 50 mmol/L 邻苯二酚溶液，最后加入100 µL 酶液开始反应，测定其在2 min 内在420 nm 处吸光度的变化值，以蒸馏水为参比调零。以每分钟吸光值变化0.01 为一个酶活力单位（U），PPO 活性以U/g 表示。

（4）过氧化物酶

过氧化物酶（peroxide，POD）活性测定采用愈创木酚法。称取1.00 g 蓝莓果肉，加入10 mL的提取缓冲液（含有1 mmol 聚乙二醇、4%交联聚乙烯吡咯烷酮和1%曲拉通X-100），在冰浴中研磨成匀浆，于4 ℃，12 000 r/min 离心作用30 min，收集上清液，低温保存备用。

取1 支试管加入0.3 mL 酶液、3 mL 25 mmol/L愈创木酚溶液（使用pH=5.5，浓度为50 mmol/L的乙酸缓冲液配制），再加入200 µL 0.5 mol/L H2O2溶液后开始反应。测定其在2 min 内在470 nm处吸光度的变化值，以蒸馏水为参比调零。以每分钟吸光值变化0.01 为一个酶活力单位（U），POD 活性以U/g 表示。

（5）苯丙氨酸解氨酶

苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活性测定参照MARINA 等［17］的方法。称取1.00 g 蓝莓果肉，加入10 mL 的提取缓冲液（含有40 g/L 聚乙烯吡咯烷酮、2 mmol/L 乙二胺四乙酸和5 mmol/L β-巯基乙醇），在冰浴中研磨成匀浆，将匀浆液全部转入离心管中，于4 ℃ 12 000 r/min离心作用30 min，收集上清液，低温保存备用。

取2 支试管，分别加入3 mL 50 mmol/L，pH=8.8 硼酸缓冲液和0.5 mL 20 mmol/L L-苯丙氨酸溶液。向其中一支试管中加入0.5 mL 酶提取液，另一支试管中加入0.5 mL 经煮沸5 min 的失活酶液作为对照；然后将2 支试管置于37 ℃保温60 min。保温结束时，立即向2 支反应管中各加入0.1 mL 6 mol/L 盐酸溶液以终止反应。以蒸馏水为参比空白调零，分别测定样品和对照反应管中溶液在波长290 nm 处的吸光度值（OD1 和OD0）。以每小时吸光值变化0.01 为一个酶活力单位（U），PAL 活性以U/g 表示。

1.3.8 数据分析

试验所有结果均进行3 次以上生物学重复试验。用 Excel 2007 软件处理数据和计算标准偏差；利用SPSS 19.0 软件进行单因素方差分析，P ＜0.05 表示各处理组间差异显著。

2 结果与分析

2.1 对腐烂率、失重率的影响

减压处理对腐烂率和失重率的影响如图1所示。

图1 减压处理对腐烂率和失重率的影响Fig.1 Effect of hypobaric treatments on the decay rate and weight loss rate

在整个冷藏期间，蓝莓的腐烂率随贮藏时间的延长而不断上升，如图1（a）所示。21 d 时，蓝莓果实的腐败率显著增加，此时CK，LP12h，LP24h 的腐烂率分别为22.78%，17.77%，6.98%。（28+2）d 时，LP12h 和LP24h 处理的果实腐败率分别为44.84%，26.76%，分别比CK 组低24.37%，42.45%。可见，适当的减压处理可有效抑制贮藏期间蓝莓果实受病原菌的侵害，并延迟其腐烂的发生时间［18］。

采后果实的失重主要由于呼吸作用及水分蒸腾，反映水分的蒸发和营养物质的消耗［19-20］。由图1（b）可知，在贮藏过程中，蓝莓果实的失重率呈上升趋势，但减压处理组果实的失重率始终显著低于CK 组（P＜0.05）。（28+2）d 时，经减压处理蓝莓果实的失重率均保持在较低水平，果实质地良好。由此可见，减压预处理有利于提高蓝莓果实的贮藏性。

2.2 对呼吸强度和可溶性固形物的影响

由图2（a）可知，在贮藏期间各组蓝莓果实呼吸均呈上升趋势。7 d 时，LP24h 组果实的呼吸强度显著低于CK 组（P＜0.05），一方面可能与减压处理所产生的低氧环境有关；另一方面减压也有利于果实内乙烯、乙醛、乙醇和O2等成分向外扩散。在（21+2）d 和（28+2）d 时，果实的呼吸强度均低于其对应的贮藏期果实，这可能与贮藏后期果实的衰老有关。货架期间，相对于CK 组，LP24h 组果实的呼吸强度仍处于较低水平，表明短时减压处理对于果实呼吸强度的抑制作用具有一定的后续效应。

图2 减压处理对呼吸强度和可溶性固形物含量的影响Fig.2 Effect of hypobaric treatments on the respiratory intensity and soluble solids content

由图2（b）可知，贮藏过程中蓝莓果实的SSC呈上升趋势，但LP12h 和LP24h 组果实的SSC 显著低于CK 组（P＜0.05）。（7+2）d 时，CK 组的SSC显著高于LP12h 和LP24h 组（P＜0.05）；（14+12）d时，各组SSC 无显著差异（P＞0.05）；而（28+2）d时，减压处理后的蓝莓果实的SSC 均高于CK 组（P＜0.05）。

SSC 组成成分主要有水溶性糖、酸、维生素及矿物质［21］。一般情况下，在果实贮藏初期，随着果实的成熟，果实内有机物质可转化为可溶性糖、氨基酸和维生素；在贮藏后期，果实开始衰老，有机物无法充足供应，呼吸作用消耗SSC，进而导致SSC 下降［22］。短时减压可抑制果实的呼吸作用，导致有机物转化成可溶性糖等物质的速率降低［23］。尽管2 kPa 低压与CK 组蓝莓果实的SSC含量均呈先升高后下降的趋势，但是低压处理延缓了果实SSC 水平的升高，且在贮藏后期维持较高的SSC 水平。

2.3 对香气成分含量的影响

酯类香气化合物具有特殊的甜香，是蓝莓果实中重要的芳香物质［24］。如图3（a）所示，蓝莓果实的总酯含量总体呈先上升后下降的趋势。所有处理组蓝莓果实的总酯含量均在21 d 达到最大，此时CK 组为266.85 µg/kg，分别为LP12h 和LP24h 处理组的1.5，1.3 倍。这说明减压处理抑制了蓝莓果实酯类的积累，且处理时间越长，抑制效果越强。

图3 减压处理对总酯、总醛、总醇和总萜烯类含量的影响Fig.3 Effects of hypobaric treatments on the contents of total esters, total aldehydes, total alcohols and total terpenes

如图3（b）所示，对于醛类物质来说，整个贮藏和货架期间蓝莓果实中的醛类含量为1 910.94～4 355.65 µg/kg，占总挥发性化合物的56%以上。第7 d 时，醛类含量最高，可占总挥发性成分的90%。在贮藏过程中，果实中总醛含量先上升后下降。可见，减压处理促进醛类的积累，且其后续效应在货架期间仍较明显。

如图3（c）所示，随着贮藏时间的延长，蓝莓的醇类物质含量呈下降趋势；14 d 后，其醇类含量趋于稳定。表明减压处理有利于抑制蓝莓醇类物质的合成。然而，贮藏后期及货架期间三者总醇含量无显著差异（P ＞ 0.05）。

如图3（d）所示，CK 组蓝莓果实的萜烯含量峰值出现在第14 d，为723.68 µg/kg，而LP12h 和LP24h 组的峰值分别出现在第7，14 d，且两峰值均小于CK 组。

萜类是小浆果类与其他果实香气成分的最主要区别［25］。对大多数蓝莓品种而言，其挥发性成分主要由醛类、醇类、萜类和烯类组成，且果实中萜类物质的种类较多，与其较高的抗氧化能力有关［26］。在整个贮藏过程中，2 kPa 低压预处理抑制了酯类和醇类，但有助于贮藏后期萜烯类物质的积累。减压处理也有利于维持贮藏后期蓝莓香气成分种类的多样化。

2.4 对总酚和类黄酮含量的影响

酚类物质对植物的抗逆境生理具有重要作用，主要是通过清除或控制由逆境产生的氧自由基，从而保护植物体免受损伤［27］。如图4（a）所示，在贮藏期间，CK 组果实的总酚含量于第7 d 时达到峰值，为3.18 mg/g，随后呈下降趋势。LP12h 和LP24h 组果实的总酚含量均在第14 d达到峰值，分别为6.40，9.58 mg/g。货架期间经减压处理的蓝莓果实的总酚含量高于CK 组，尤其是LP24h 组。这表明减压预处理有助于提高冷藏过程中蓝莓果实的总酚含量，使其抗氧化活性维持在相对较高水平。

图4 减压处理对总酚和类黄酮含量的影响Fig.4 Effect of hypobaric treatments on the contents of total phenols and flavonoids

由图4（b）可见，短时减压处理组和CK 组的类黄酮含量的变化趋势与总酚一致。减压处理可显著提高贮藏时蓝莓果实的类黄酮含量，且24 h 减压处理强于12 h 减压处理。对于货架期间，减压处理蓝莓果实的总酚和类黄酮含量均在减压后迅速升高，并在随后的贮藏和货架期间也一直处于较高水平。说明短时减压可以有效提高果实采后抗氧化能力，且类黄酮物质在减压处理应激响应过程中可能起到较为重要的作用。

2.5 对抗性酶活性的影响

如图5（a）所示，在贮藏过程中，蓝莓果实中CAT 含量呈先上升后下降的趋势，峰值出现在第21 d。LP24h，LP12h 和CK 组的峰值量分别为485.00，306.67，218.33 U/g。由此可见，短时减压可以诱导CAT 活性的增加，且24 h 减压处理的效果更好。

图5 减压处理对CAT，POD，PPO 和PAL 活性的影响Fig.5 Effect of hypobaric treatments on the activities of CAT、POD、PPO and PAL

由图5（b）可知，在贮藏期间，所有处理组蓝莓果实的POD 活性均呈先上升后下降趋势，且均在第7 d 达到峰值，分别为275.00，305.00，471.90 U/g。减压处理24 h 可有效提高果实在冷藏期间POD 活性，并延缓其常温货架期间POD 活性的下降，从而维持果实内的氧化还原平衡。

由图5（c）可知，在贮藏前期（7 d），减压处理组的PPO 活性与CK 组无显著差异（P ＞0.05）；在贮藏后期（21 d 和28 d），减压处理组的PPO活性显著高于CK 组（P ＜ 0.05）。在货架期间，除第14 d 外，减压处理组蓝莓果实的PPO 活性均显著大于CK 组（P ＜ 0.05）。

从图5（d）可见，在贮藏期间，3 组果实PAL呈先上升后下降的趋势。减压处理组果实的PAL活性上升较快，在第21 d 时达到最大值，LP12h和LP24h 组分别为22.82，27.90 U/g，且显著高于CK 组（P ＜ 0.05）。前人研究表明，50 kPa 减压处理12 h 后，草莓果实的PAL 活性也呈现类似趋势［28］。在货架期间，LP24h 组蓝莓果实的PAL活性始终保持显著高于CK 组（P ＜ 0.05）。

果实中PAL，POD，PPO 等防御酶可通过诱导组织中酚类物质、木质素等次生代谢产物合成，间接提高果实抗性［29］。短时减压处理可迅速提高蓝莓果实中SOD，CAT，PPO，POD，PAL 等抗性酶的活性，且贮藏及货架期间SOD，CAT，PAL 酶活性维持在相对较高水平。这可能是减压处理后蓝莓腐败率较低的可能原因之一。因为减压环境对于果实本身是一种逆境，刺激果实产生抗性，导致其相关抗性酶活性的增加，从而防止过氧化损伤，有利于保持细胞的正常结构，保护果实正常代谢机能，有助于蓝莓果实更好地抵御外界微生物的入侵，并最终延缓果实贮藏期衰老和腐烂。HASHMI 等［29］的研究结果与本文一致。

3 结语

经短时减压处理可抑制蓝莓果实的呼吸强度，减少其营养物质损耗；抑制香气成分中酯类、醇类物质的产生，但保持贮藏后期萜烯类物质的积累水平；提高果实的总酚和类黄酮的含量，增强果实中抗性酶活性，进而强化其抗氧化能力。因此，2 kPa 低压预处理有助于维持蓝莓果实的贮藏品质。在今后的研究中，可探究如何将减压预处理与其他现有技术（如植物精油熏蒸）有效结合，以提高蓝莓果实的耐贮藏能力并延长其货架期，以进一步推进低压技术在果蔬保鲜领域的实际应用。