右美托咪定对脓毒症小鼠认知功能及HSP70表达的影响*

赵园园， 邱高林， 蔡雯， 周静文， 李元海， 夏晓琼， 张梦英

（1.安徽医科大学附属巢湖医院 麻醉科， 安徽 巢湖 238000； 2.安徽医科大学第一附属医院 麻醉科， 安徽 合肥 230031）

脓毒症是机体对感染反应失调所致的脏器功能障碍综合征，脓毒症相关性脑病（sepsis-associated encephalopathy, SAE）是脓毒症的中枢系统并发症，与脑内炎症、氧化应激有关，病死率较高，幸存者多存在长期认知缺陷，但目前尚无有效的治疗方式[1]。热休克蛋白70（heat shock protein70, HSP70）是热休克蛋白家族的重要成员，是一种高度保守的蛋白，作用广泛，能协助蛋白正确地折叠、促进异常蛋白的降解、阻止Tau 蛋白和Aβ 聚集、抑制神经炎症与氧化应激，在神经退行性疾病、血管性脑病中发挥脑保护作用[2-5]。

右美托咪定（Dexmedetomidine, Dex）是一种高选择性的α2 受体激动剂，兼具镇静与镇痛作用，广泛用于临床麻醉和重症监护室镇静。有研究显示，Dex 定能通过抗炎、抗氧化、抗交感、降低氨基酸毒性、减少神经元凋亡等机制改善脓毒症患者认知功能[6-7]，但HSP70 是否参与其脑保护过程目前尚不清楚。本研究以脂多糖（Lipopolysaccharide, LPS）复制脓毒血症相关的认知障碍模型，探讨Dex 对脓毒症小鼠认知功能的影响和HSP70 表达的调控，为其脑保护机制的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级雄性C57BL/6 小鼠[实验动物生产许可证号：SCXK（皖）2022-001，实验动物使用许可证号：SYXK（皖）2020-001]80 只，周龄7～8 周，体重20～25 g，购于安徽医科大学实验动物中心。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

1.2.1 主要试剂 盐酸右美托咪定注射液（扬子江药业集团有限公司，批号：22041031），LPS（上海优宁维生物科技股份有限公司，批号：abs42020800），BCA 蛋白定量试剂盒（爱必信生物科技股份有限公司，批号：abs9232），过氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性、谷胱甘肽（Glutathione, GSH）和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A001-1-3-2、A006-2-1、A003-1-2），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）、白细胞介素-1β（Interleukin-1β, IL-1β）酶联免疫吸附试验（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，批号：PI303、PT512），RNA 提取液、Synthesis Super Mix for qPCR 和2×SYBR Green qPCR Master Mix（武汉赛维尔科技有限公司，批号：G3013、G3337、G3320），HSP70 单克隆抗体、免疫组织化学染色试剂盒（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：66183-1-lg、PK10018）。

1.2.2 主要仪器 低速冷冻离心机（型号：KDC-2046，安徽中科中佳科学仪器有限公司），酶标仪[型号：Multiskan FC，赛默飞世尔（上海）仪器有限公司]，荧光定量PCR 仪[型号：CPX96 Touch，伯乐生命医学产品（上海）有限公司]，生物显微镜（型号：DM2500，德国徕卡公司）。

1.3 方法

1.3.1 动物分组与模型复制 将C57BL/6 小鼠随机分为对照组（CON 组）、单纯Dex 组（Dex 组）、脓毒血症组（LPS 组）和Dex + 脓毒血症组（D + L 组），每组20 只。首先，Dex 组和D + L 组按照参考文献[8]方法，腹腔注射Dex 25 μg/kg，CON 组和LPS 组腹腔注射等剂量的生理盐水；30 min 后LPS 组和D+L 组参 照 文 献[9] 腹 腔 注 射 5 mg/kg 脂 多 糖（Lipopolysaccharide, LPS）复制脓毒血症模型，CON 组和Dex 组腹腔注射等剂量的生理盐水。

1.3.2 Morris 水迷宫实验 每组给药后24 h 随机选8 只小鼠进行实验。Morris 水迷宫为直径100 cm，深30 cm 的圆形水池，水温控制在（22±1）℃，将直径10 cm 的圆形平台放入目标象限，并隐匿于水面下1 cm。第1～5 天进行定位航行实验，每日将小鼠面向池壁从4 个象限依次放入水中，记录每次爬上平台的时间（逃避潜伏期），若60 s 内未爬上平台则按60 s 计算，并引导其至平台上停留30 s。第6 天进行空间探索实验，撤离平台，将小鼠从原平台对侧的象限放入水中，记录小鼠60 s 内在目标象限的停留时间及穿越平台的次数。

1.3.3 ELISA 检测血清TNF-α 和IL-1β 水平 每组给药后24 h 取8 只小鼠眼球取血，室温静置2 h，4℃、3 000 r/min 离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书操作，采用ELISA 检测小鼠血清TNF-α、IL-1β 水平。处死小鼠取海马组织，置入-80 ℃冰箱冷冻保存备用。

1.3.4 化学比色法检测海马组织SOD 活性和GSH、MDA 水平 取备用的海马组织清洗称重，按质量∶体积=1∶9 加入生理盐水，用组织匀浆器在冰上充分研磨制备10%海马组织匀浆，4 ℃、3 000 r/min 离心10 min 后取上清液，采用BCA 法测定海马组织蛋白浓度，化学比色法测定SOD 活性和GSH、MDA 水平。

1.3.5 苏木精-伊红（hematoxylin-eosin, HE）染色观察小鼠海马组织病理变化 每组给药后24 h 取4 只小鼠断颈处死，冰上分离出完整的海马组织，用4%多聚甲醛固定，经脱水、石蜡包埋和切片制备成4 μm 厚的切片，烘干备用。每只取3 张切片，经二甲苯和酒精脱蜡至水后进行HE 染色，于400 倍显微镜下观察海马CA1 区组织形态变化。

1.3.6 免疫组织化学染色检测海马组织HSP70 蛋白的表达 取制备的海马切片，每只3 张切片，常规脱蜡和水化后抗原热（96～98 ℃）修复20 min，ddH20润洗、缓冲液浸泡；滴加封闭液湿盒内封闭30 min；滴加2 μg/mL 的HSP70 一抗50 μL 湿盒中孵育1 h，缓冲液洗涤2 次，1 min/次；滴加2～4 滴二抗湿盒中孵育30 min，缓冲液洗涤3 次，1 min/次；滴加DAB，变色后缓冲液冲洗，ddH20 浸泡3～4 次、30 s/次；滴加信号加强液，孵育5 min，缓冲液润洗，复染、封片。显微镜下观察海马CA1 区，应用Image J 软件分析免疫组织化学染色结果，阳性细胞率=视野内阳性细胞数/细胞总数×100%。

1.3.7 实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative realtime polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测海马组织HSP70 mRNA表达 取适量海马组织，按10 mg组织中加100 μL RNA 提取液的比例研磨均匀，提取总RNA，根据试剂盒说明书进行逆转录和qRTPCR。HSP70 正向引物：5'-CCGACAAGGAGGAGTTC GTG-3'，反向引物：5'-ACAGTAATCGGTGCCCAAGC-3'，长度均为249 bp；GAPDH 正向引物：5'-CCTCGTCCCGTAGACAAAATG-3'，反向引物：5'-TGAGGTCAATGAAGGGGTCGT-3'，长度均为133 bp。反应条件：95 ℃预变性30 s、95 ℃变性15 s、60 ℃退火并延伸30 s，共40 个循环。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算HSP70 mRNA 相对表达量。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 22.0 统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，两两比较用LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠Morris水迷宫实验指标比较

各组小鼠第1、2、3、4、5 天逃避潜伏期比较，经重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的逃避潜伏期比较，差异有统计学意义（F=206.485，P=0.000）；②各组小鼠的逃避潜伏期比较，差异有统计学意义（F=14.576，P=0.000），LPS 组较CON 组延长，D+L 组较LPS 组缩短；③各组小鼠逃避潜伏期变化趋势比较，差异有统计学意义（F=3.877，P=0.020）。见表1。

表1 各组小鼠不同时间点逃避潜伏期比较 （n =8， s， ±s）

表1 各组小鼠不同时间点逃避潜伏期比较 （n =8， s， ±s）

组别第1天第2天第3天第4天第5天CON组Dex组LPS组D + L组46.66±9.27 46.86±10.04 48.92±11.24 47.98±9.52 29.47±4.49 30.88±3.76 33.56±4.47 33.45±3.18 22.30±4.78 21.31±5.97 30.21±3.72 24.78±2.93 11.33±2.93 14.53±5.79 22.69±2.56 17.18±6.08 5.23±1.49 6.67±2.09 20.05±2.34 11.18±2.95

空间探索实验结果显示，各组小鼠游泳速度比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。各组小鼠目标象限停留时间、穿越平台次数比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），LPS 组目标象限停留时间短于CON组，D+L 组长于LPS 组；LPS 组穿越平台次数少于CON 组，D+L 组多于LPS 组。见表2。

表2 各组小鼠空间探索结果比较 （n =8， ±s）

表2 各组小鼠空间探索结果比较 （n =8， ±s）

注：①与CON组比较，P ＜0.05； ②与LPS组比较，P ＜0.05

组别穿越平台次数游泳速度/（cm/s）目标象限停留时间/s CON组Dex组LPS组D + L组F 值P 值8.13±1.55 6.75±2.12 4.13±1.13①6.38±1.19②9.190 0.000 23.99±2.67 23.10±1.66 24.59±2.17 23.24±2.27 0.779 0.515 31.65±5.63 29.06±5.96 20.33±3.74①28.05±4.28②7.632 0.001

2.2 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平比较

各组小鼠血清TNF-α、IL-1β 水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），LPS 组较CON 组升高，D+L组较LPS 组降低。见表3。

表3 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平比较（n =8， pg/mL， ±s）

表3 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β水平比较（n =8， pg/mL， ±s）

注：①与CON组比较，P ＜0.05； ②与LPS组比较，P ＜0.05。

组别IL-1β TNF-α CON组Dex组LPS组D + L组F 值P 值25.50±5.90 26.26±6.58 65.85±9.05①41.94±4.58②63.101 0.000 57.12±12.29 57.38±15.07 154.80±17.50①86.13±9.15②88.232 0.000

2.3 各组小鼠海马组织SOD、GSH、MDA水平比较

各组小鼠海马组织中SOD、GSH、MDA 水平比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），LPS 组GSH、SOD 水平较CON 组降低，MDA 水平较CON 组升高，D+L 组GSH、SOD 水平较LPS 组升高，MDA 水平较LPS 组降低。见表4。

表4 各组海马组织中氧化应激水平比较 （n =8， ±s）

表4 各组海马组织中氧化应激水平比较 （n =8， ±s）

注：①与CON组比较，P ＜0.05； ②与LPS组比较，P ＜0.05。

组别MDA/（nmol/mg·prot）SOD/（u/mg·prot）GSH/（nmol/mg·prot）CON组Dex组LPS组D + L组F 值P 值1.11±0.27 1.25±0.24 2.60±0.32①1.85±0.26②49.576 0.000 127.41±17.22 126.21±15.98 56.58±6.80①97.79±8.42②52.816 0.000 26.72±4.62 23.60±4.74 9.75±2.29①16.50±3.02②31.614 0.000

2.4 各组小鼠海马CA1区病理变化

HE 染色结果显示，CON 组和Dex 组海马CA1 区神经元结构完整，排列整齐，核染色清晰；LPS 组海马CA1 区神经元数量减少，排列紊乱，大量细胞染色加深、核固缩；D+L 组海马CA1 区上述病理改变较LPS 组减轻，受损细胞明显减少。见图1。

图1 各组小鼠海马CA1区病理变化 （HE染色×400）

2.5 各组小鼠海马组织HSP70 蛋白阳性表达率比较

CON 组、Dex 组、LPS 组、D + L 组小鼠海马CA1区HSP70 蛋白阳性表达率分别为（15.55±1.67）%、（17.80±3.13）%、（43.13±2.55）%、（63.63±3.17）%，经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=285.419，P=0.000），LPS 组较CON 组升高（P＜0.05），D+L 组较LPS 组升高（P＜0.05），Dex 组与CON 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图2。

图2 各组小鼠海马CA1区HSP70蛋白阳性表达情况 （免疫组织化学×400）

2.6 各组小鼠海马组织HSP70 mRNA 相对表达量比较

CON 组、Dex 组、LPS 组、D+L 组小鼠海马组织HSP70 mRNA相对表达量分别为（1.03±0.29）、（1.30±0.19）、（1.97±0.11）、（3.24±0.54），经单因素方差分析，差异有统计学意义（F=73.024，P=0.000），LPS 组较CON 组升高（P＜0.05），D+L 组较LPS 组升高（P＜0.05），Dex 组与CON 组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

3 讨论

SAE 是脓毒血症最常见的器官功能障碍之一，病理机制复杂，主要表现为认知功能和意识受损。据统计，9%～71% 脓毒症患者伴有不同程度的SAE，给患者及其家庭造成极大痛苦[10]。HSP70 是细胞在应激刺激下分泌的自我保护性蛋白，细胞内的HSP70 能降低脓毒症的氧化应激水平，减少LPS 诱导的小胶质细胞活化，降低活性氧和TNF-α 生成，减少神经细胞坏死和凋亡，缓解脓毒症相关的中枢炎症与认知能力下降[5,11-13]。研究显示，Dex 对SAE具有脑保护作用，但具体作用机制不详[14]。ZHANG等[8]发现Dex 可通过上调海马组织HSP70，抑制神经元凋亡，改善脑缺血大鼠的认知障碍；LU 等[15]发现，使用常规药物联合腹腔注射Dex 进行CPR 时，显著提高了复苏大鼠的神经功能，并且证实与Dex 增加海马组织HSP70 的表达有关。这些研究提示Dex 可能通过HSP70 改善SAE 的认知功能。

海马是学习和记忆形成的重要位置，CA1 区是海马中的缺血缺氧脆弱区，与空间学习记忆密切相关，LPS 是G-杆菌细胞壁主要成分，腹腔注射后能迅速提高血清炎症因子，并诱发海马组织出现氧化应激迹象，导致神经元萎缩和降低损伤空间认知能力[16-18]，因此笔者选择腹腔注射LPS 复制SAE 模型。结果显示，LPS 组小鼠腹腔注射LPS 后血清中IL-6、TNF-α 明显升高，海马组织中SOD 活性和GSH 水平降低、MDA 水平升高，海马CA1 区出现神经元损伤，并且在Morris 水迷宫实验中逃避潜伏期延长，目标象限停留时间和穿越平台次数减少，说明SAE 模型复制成功。而D + L 组预先给予Dex 降低脓毒症小鼠体内的炎症和氧化应激水平，减轻海马CA1 区的神经元损伤，缩短了逃避潜伏期，增加目标象限停留时间和穿越平台次数，说明Dex 在脓毒症中具有一定的脑保护作用，但是否与HSP70 相关尚不清楚。本研究通过qRT-PCR 和免疫组织化学实验检测了各组小鼠海马组织内HSP70 mRNA 和蛋白的表达，结果显示，与对照组比较，LPS 组小鼠海马组织HSP70 mRNA 相对表达量及蛋白阳性表达率升高，这可能与LPS 的刺激有关[19]。文献显示，LPS 暴露2～6 h 后细胞内HSP70 表达增加，但增加量相对较少并且多在12 h 后开始下降，不足以抵抗LPS 所致的损伤[20-21]，故可解释LPS 组小鼠体内炎症和氧化应激水平的升高及SAE 的发生。而与LPS 组比较，D+L 组小鼠海马组织HSP70 mRNA、蛋白表达被进一步上调，说明预先腹腔注射Dex 可增加脓毒症小鼠海马内的HSP70 转录与表达。有研究发现，HSP70 能通过抑制核因子-κB，降低炎症因子释放、干扰诱导型一氧化碳合酶合成与提高核转录因子E2 相关因子2/血红素氧合酶1，减少活性氧产生，从而提高细胞应激耐受能力，减少神经细胞损伤[3，22]，与本研究结果一致。因此，笔者推测Dex 可能通过上调HSP70 改善SAE 小鼠的认知功能。

综上所述，本研究初次在脓毒症模型中探讨Dex 的认知保护作用与海马组织HSP70 表达的关系，推断Dex 可能通过上调HSP70 缓解脓毒症小鼠的炎症反应和氧化应激水平，减轻海马组织损伤程度，改善脓毒症小鼠的认知障碍，为探讨Dex 脑保护的新机制提供参考。但是，本研究未就Dex 调控HSP70 表达做剂量相关性研究，且未对其具体过程进一步探究，将在后期的实验中继续补充。