药用真菌菌种质量的研究进展

蔡 凌,魏盟想,贺黎铭,谢 欣,罗 舒,李 芳,罗 霞

(四川省中医药科学院/菌类药材系统研究与开发实验室/中药材品质及创新中药研究四川省重点实验室,成都 610041)

药用真菌包括属子囊菌纲的冬虫夏草、蝉花、竹黄等,以形成子囊孢子的方式来繁殖,和属担子菌纲的马勃、茯苓、灵芝、猪苓、雷丸等,以形成担孢子的方式来繁殖。目前实际科研和生产中,几乎所有药用真菌种质资源在保藏过程中都面临着不同程度的退化,如何保证菌种质量是当今急需解决的关键问题。

1 退化现象

药用真菌菌种退化最直观的表现为某些优良性状的劣化,它发生在菌种培养、保存的各个时期,具体表现为菌丝体生长速度变缓,长势变弱;菌丝变干变瘪,甚至发生自溶现象;菌落变稀变薄,呈扇形或者角状,出现假色素积累或假拮抗反应;菌种生长能力下降,原基数量变少,子实体变小,影响产量、品质,甚至不产子实体等。王殿振等[1]发现北虫草菌种在液体菌种培养过程中,菌龄过大会会发生菌丝体自溶现象。孟小丽等[2]发现镜检蛹虫草正常菌丝较为粗壮挺立、分生孢子为念珠状,退化菌丝则比较纤细弯曲,分生孢子呈头状或山丘状。胡中娥等[3]发现蛹虫草菌种传代超过3次,出现菌丝生长速度下降,见光转色能力变差,子实体的产量明显下降甚至不产子实体。

2 影响退化因素

2.1 遗传学和细胞学原因

菌种退化的本质是染色体的变异,主要由于基因突变引起[4]。李美娜等[5]研究发现退化蛹虫草菌种和正常菌种有不少于2个位点的差异,第279和第360个碱基处发生了T到C碱基突变。何晓红等[6]发现蛹虫草退化因为其核型发生改变、基因存在突变、胞内有害物质出现积累和病毒的入侵等。汪虹等[7]发现蛹虫草正常菌株为异核体而退化现象菌株为同核体,发生不形成子实体的菌种退化现象的原因之一是核相发生改变。

2.2 环境因素

影响药用真菌菌种质量的环境因素及相应的解决措施有诸多报道,菌种培养或保藏时的养分、温湿度、氧气含量、转管次数、保藏时间、都将影响菌种质量[8-13]。培养基的营养成分过于丰富或过于贫瘠都将引起菌种退化。胡秀彩[14]等研究发现菌种的退化与培养条件和转接次数有很大关系。孟小丽等[2]发现蛹虫草菌种保藏时间过长或保藏温度不当均可引起菌种退化,传代次数多的菌种甚至出现菌丝长速度缓慢,子实体转色能力差,产量下降等。

3 保藏方法

菌种的常用保藏方法有斜面低温保藏法、液体石蜡保藏法、菌丝液体保藏法、木屑、木块、枝条保藏法、液氮超低温保藏等。原理是根据菌种特性,创造缺氧、低温或干燥的环境,降低微生物代谢水平,使其休眠或生命活动基本停滞,保有更加稳定的遗传物质。

3.1 斜面低温保藏法

斜面低温保藏法是将菌种接种在具橡胶塞的斜面培养基上,待菌丝长满斜面时,置于4℃的冰箱保藏。因为菌种还在继续生长,试管内培养基易失水变干,需要每隔6个月转管1次,因此,保藏时间较短,转管次数较多,不适于长期保藏。郭玲玲[15]发现经常更换培养基配方可防止同一菌种长期使用同一培养基,因某些酶和活性物质长期得不到启用而钝化或丧失活力,出现菌丝生长速度会减慢现象。

3.2 液体石蜡保藏法

液体石蜡保藏法是在斜面低温保藏法基础上加入液体石蜡防止培养基水分蒸发,隔绝菌丝和空气接触,使菌种处于休眠状态,保持菌种优良种性。一般可保藏3～5年,是一种中长期的菌种保藏方法。李钟庆等[16]用矿油保藏的44属63种181株菌株中紫芝、灵芝、茯苓,保藏5～7年全部存活,第8年时仅紫芝失活,栽培试验发现矿物油封藏后均能形成子实体。

3.3 菌丝液体保藏法

菌丝液体保藏法是将液体培养的菌丝球保藏在生理盐水或者营养液中的一种方法。王明霞[17]综述提到据黑龙江应用微生物研究所菌种保藏研究室报道,紫灵芝菌种菌丝体生理盐水保藏可存活1.5年。刘风春等[18]用营养液保存36株担子菌中紫芝、灵芝、茯苓菌丝球保存33个月和42个月后全部存活,菌种块仅紫芝42个月时失活,其余全部存活,较生理盐水保藏表现优异。

3.4 木屑、木块、枝条保藏法

木屑、木块、枝条保藏法是指在试管中加入一定比列的木屑、木块、枝条等培养基料待菌丝体满管后进行低温保藏的一种方式。刘风春等[19]将杂有小木片的木屑加水拌匀,或在木屑中加入营养物质,均获得较好的保藏效果。戴肖东等[20]用木屑保藏法保藏灵芝菌种7年后仍然保持很好活性。邵晨霞等[21]发现木屑管保藏法适用于茯苓的长期保藏。

3.5 液氮超低温保藏法

液氮超过低温保藏法是将菌种和保护剂一起装入安瓿瓶内,再放入液氮(-196℃)中或隔氮超低温环境中(-135℃左右)进行保藏,由于菌种处于超低温环境,其代谢降低到完全停止的状态,是目前菌种长期保藏最有效、最可靠的方法。Morris等[22]发现快速冷冻对大部分担子菌、结合菌和子囊菌,菌丝体内的细胞影响较小。Homolka等[23-24]使用珍珠岩作为载体与常规琼脂为载体进行液氮保藏的效果比较具有绝对优势。Hubalek[25]认为保护剂效果较好的是二甲基亚砜、甲醇、乙二醇、丙二醇等。顾金刚等[26]表明降温方式、解冻方式、保护剂是液氮超低温保藏技术的3个关键因素。王华等[27]研究发现冰晶的形成、渗透压、保护剂毒性给细胞造成多种胁迫并对细胞有一定的损害。谢航等[28]优化灵芝菌种的液氮保藏工艺,分析降温程序、培养基、菌饼大小、甘油浓度和解冻方式等方面对菌种保藏的影响。

3.6 其他保藏方法

生产中常常会用到普通冰箱对菌种进行暂时保藏,王晓敏等[29]研究发现保护剂含量是影响-20℃低温保藏灵芝菌株活性的关键因素,最优保护剂配方为蔗糖5.8%、甲醇8%、丙三醇4.7%。贵州农学院了文奇曾用麦粒保藏灵芝也获得良好效果。Voyron等[30]采用6种低温保藏方法和12种冻干保藏方法进行对比,认为冻干保藏不适合灵芝属真菌的保藏。

4 评价指标及检测方法

菌种质量的检测主要包括菌种真实性、菌种活力、菌种纯度、农艺性状等几方面的主要内容。菌种真实性是指名称与栽培性状是否一致[31]。陈世林等[32]应用分子生物学技术基于ITS序列建立了灵芝DNA条形码,应用效果显著,得到了广泛的认可。目前黑龙江、山东、四川、天津等省市出台了灵芝菌种的地方标准[33-37],从菌种直观形态包括:菌株的成活率、接种物存活率、菌丝、菌落形态、产菇能力、子实体性状、生物学效率等进行规范。但这些检测指标对于表观现象不明显的菌种活力减弱的预判性差。结实性试验周期长,属于事后评价,不能进行预判,具有明显的缺陷。研究者们通常采用生理生化检测手段,来获得可以量化的菌丝体代谢数据,评价菌种活力。微观生理活性指标包括:相关酶活的测定(纤维素酶、漆酶等)、酯酶同工酶谱和可溶性蛋白带的变化、DAN检测、发酵产物的变化(虫草素、虫草多糖、多糖等)等[8, 24-25, 30,38-39]。

4.1 相关酶活的测定

脱氢酶的活性可反应细胞活性强弱,漆酶可以选择性降解栽培料中木质素,纤维素酶可分解其中植物纤维,已经成为菌种活力强弱的检验指标。刘淑琴等[40]发现蛹虫草液体菌种脱氢酶含量和其子实体的产量成正比。林清泉等[41]发现蛹虫草正常菌株的脱氢酶活性高于退化菌株。黄春花等[42]优化的蛹虫草TTC-脱氢酶活性检测方法,使得测定结果重现性好、准确度高、操作更简便。暴增海[43]等提出纤维分解酶活性增加与子实体生理生化关系密切。

4.2 DAN检测

随着分子技术及测序技术的发展,药用真菌种质资源的鉴定评价从早期的表型性状鉴定发展到分子水平的基因型鉴定。李美娜等[5]应用RFLP和RAPD两种分子标记技术获得了关于正常菌株和退化菌株之间DNA水平的差异。冯德龙等[44]基于交配型基因分子标记研究了优良性状蛹虫草野生菌W141436 的退化机制。

5 复壮方法

5.1 组织分离复壮技术

组织分离复壮技术操作简便易学,能够保持菌株的优良性状。耿向勇等[45]采用组织分离技术分离西藏野生灵芝,最终获得具有出菇能力强的的灵芝菌株。诸发会[46]采用组织分离方法分离茯苓菌株,并进行菌丝形态及荧光核染色显微观察。胡中娥等[47]发现北冬虫夏草经过组织分离加复壮处理后,菌丝活力提高,鲜草产量明显提高。方华舟[48]发现蛹虫草采用组织分离方法获得优良菌种率高于孢子培养方法,且更有利于保持母本性状。

5.2 尖端分离技术

菌种的生长繁殖是由于尖端菌丝的不断生长伸长、分支扭结而形成菌丝体。尖端菌丝的活力、纯度等都具有一定优势,挑取健壮菌丝体顶端部分,进行纯化培养,可保持菌种的纯度,恢复原来的生活力和优良种性,达到复壮的目的。黄晓润等[49]采用尖端分离技术分离红托竹荪菌种,3株复壮菌株长势浓密。孙彦平等[50]对滑子菇菌种退化严重品种,通过尖端分离技术进行提纯复壮,筛选出菌丝长势一致的且均一的菌种。

5.3 原生质体再生技术

菌种细胞在混合酶的作用下裂解细胞壁,形成的原生质球同样具有再生能力。熊欢[51]利用原生质体技术复壮茯苓菌株,获得高于出发菌株产量的复壮菌株。李云梦[52]发现原生质体分离技术较组织分离、尖端分离分离的菌株菌丝长速、漆酶活性、第一潮菇产量高。药用真菌种是否存在相同情况,目前暂无相关研究证明。

5.4 其他分离方法

除无性繁殖复壮外,还采用有性孢子分离和筛选。夏淑春等[53]采用基内菌丝分离法、子囊孢子分离法、分生孢子分离法等进行蛹虫草菌种复壮,对比发现子囊孢子分离法和蚕蛹回接法复壮效果显著优于分生孢子分离法。王殿振等[54]采用蚕蛹回接法、组织分离复壮法、孢子分离法等进行北虫草菌种复壮,对比发现蚕蛹回接法效果最佳。

6 展望

药用真菌菌种质量从退化机制,保藏方式,评价指标都有深入的研究,但不同种质资源所适合的保持方式不同,同种保藏方式采取不同保藏工艺保藏效果不同,可进一步加强对保藏工艺的优化和阐明保藏过程生理变化及分子机理。为科学、稳定、高效地保藏菌种提供理论支持,最终解决菌种保藏中菌种退化的难题。再结合适宜不同药用真菌的复壮方式,进一步确保菌种特性和优良的产品性状,保障消费者对优质菌类中药材日益增长的需求。