基于肝脏蛋白质组学探讨加味丹栀逍遥散的抗抑郁作用及机制

汪保英,李雅静,田磊,刘辉,白明,栗俞程,许二平

(河南中医药大学 a.中医药科学院;b.药学院,郑州 450046)

抑郁症是一种以显著而持久的心境低落为主要临床特征的精神性疾病,其发病机制复杂,涉及系统众多.目前临床上的三、四环类,选择性五羟色胺再摄取抑制剂等抗抑郁药物起效慢、不良反应多,且对约1/3病人无效[1-2].

抑郁症属于中医“郁证”范畴,郁证的关键是肝郁.丹栀逍遥散出自清代薛己之《内科摘要》,具有疏肝解郁,健脾和营,兼清郁热之功效.加味丹栀逍遥散源于本课题组长期临床经验,是在丹栀逍遥散组方基础上添加石菖蒲、远志2味中药,具有疏肝健脑解郁之功效.课题组前期临床研究表明,加味丹栀逍遥散治疗抑郁症临床疗效显著[3-4],其抗抑郁作用机制与调节脑内5-羟色胺、去甲肾上腺素、多巴胺等神经递质的含量[5-6],改善下丘脑-垂体-肾上腺(HPA)轴功能亢进[7]、调节海马内盐皮质激素受体和糖皮质激素受体平衡相关[8].现有的研究较少从“肝郁”角度探讨中医药的抗抑郁作用机制.基于此,本文采用定量蛋白组学技术系统分析抑郁症小鼠肝脏蛋白组学水平的变化,揭示加味丹栀逍遥散从肝论治抑郁症的生物学基础,为阐释传统中医理论的科学内涵提供理论依据,为研究中药复方的药理作用机制提供科学参考.

1 材料与方法

1.1 实验药物

加味丹栀逍遥散由柴胡12 g、当归10 g、白芍12 g、白术10 g、茯苓10 g、甘草3 g、薄荷6 g、丹皮12 g、栀子12 g、石菖蒲12 g、远志12 g组成,购自河南中医药大学第一附属医院中药房,经中药教研室陈随清教授鉴定符合《中华人民共和国药典》(2020年版)规定.

1.2 实验动物

30只SPF级雄性C57BL/6N小鼠,6～8周龄,体质量(20±2) g,购于北京维通利华实验动物技术有限公司,生产许可证号:SCXK(京)2021-0006.单笼饲养,适应性喂养1周后开始实验.所有动物实验经河南中医药大学实验动物伦理委员会批准进行(DWLL201903018).

1.3 主要试剂与仪器

试剂SDS、BSA、Tris 购于上海生工,碘乙酰胺、NH3·H2O、二硫苏糖醇(DTT)、HCOONH4、C18 EmporeTM固相萃取圆盘购于美国Sigma公司,BCA 定量试剂盒购于碧云天生物技术公司,TMT 6/10plex Isobaric mass tag labeling kit购于美国Thermo Fisher Scientific公司,C18 Cartridge购于Waters公司,总胆固醇及总胆汁酸检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所.

Easy nLC 色谱系统、Nano Drop 3000、 Q Exactive plus质谱仪及Multiskcan FC酶标仪购于美国Thermo Fisher公司,Agilent 1260 infinity II HPLC 系统购于美国Agilent公司,电泳仪购于美国BIO-RAD公司,小鼠自主活动仪购于四川泰盟公司.

1.4 实验方法

1.4.1造模与分组

将小鼠随机分为正常组10只和刺激组30只,根据WILLNER等[9]的方法稍作调整建立CUMS小鼠模型.刺激组接受CUMS刺激,8周后将其随机分为模型组、氟西汀组、加味丹栀逍遥散组,每组10只小鼠,连续灌胃给药4周,加味丹栀逍遥散组给药剂量31.7 g/kg(等效临床剂量),氟西汀组给药剂量10 mg/kg,正常组和模型组灌胃等体积生理盐水.除正常组外,给药期间同时给予CUMS.

1.4.2行为学测试和组织样本的采集

末次给药后进行糖水偏好试验(SPT)和自主活动试验(LAT).计算蔗糖水偏好率,糖水偏好率=(蔗糖水摄入量/蔗糖水和纯水摄入总量),记录5 min的活动总次数.行为学测试结束后摘眼球取血,分离血清,取小鼠肝脏样本,液氮速冻后转移至-80 ℃冰箱保存待测.

1.4.3蛋白组学测试

蛋白质样品前处理及TMT标记.取肝组织样本加入适量SDT裂解液(质量分数4%SDS,100 mmol/L Tris-HCl,pH7.6),采用MP Fastprep-24自动均浆器匀浆(转子线速度6.0 m/s,30 s,2次),超声后煮沸15 min,14 000 g离心40 min后,用0.22 μm的过滤器过滤,滤液用BCA法检测蛋白含量.用过滤器辅助样品制备方案(filter-aided sample preparation,FASP)酶切蛋白质[10-11].取样品200 μg先后加入30 μL SDT缓冲液(质量分数4%SDS,100 mmol/L DTT,150 mmol/L Tris-HCl pH8.0)、200 μL UA缓冲液 (8 mol/L Urea,150 mmol/L Tris-HCl pH 8.5)超滤离心后,加入100 μL碘乙酰胺(IAA)(100 mmol/L IAA in UA buffer),室温避光反应30 min后洗涤, 4 μg胰蛋白酶消化,37℃放置过夜,收集肽段滤液后脱盐、定量(OD280).每个样品取100 μg肽段,按照TMT标记试剂盒(Thermo Fisher公司)说明书进行标记.

High PH RP分级及质谱分析.采用Agilent 1260 infinity II高效液相色谱法对TMT标记的多肽进行分馏、稀释后,上样到XBridge Peptide BEH C18柱进行分离,收集馏分、干燥.采用Easy nLC系统分离后用Q Exactive plus质谱仪(Thermo Fisher Scientific)进行质谱分析.

采用Mascot 2.6和Proteome Discoverer 2.1(Thermo Fisher Scientific)软件对质谱原始数据raw文件进行查库鉴定及定量分析.设定差异倍数(fold change)>1.2、P<0.05的蛋白质是差异表达蛋白.

1.4.4生信分析

利用Blast2GO[12]对差异蛋白进行GO注释,利用 KOALA(KEGG orthology and links annotation)软件[13]对差异蛋白进行KEGG通路注释,然后进行GO及KEGG富集分析.采用Matplotlib软件从2个维度对样本和蛋白质表达量进行分类,并生成层次聚类热图.

1.4.5血清总胆固醇及总胆汁酸检测

按试剂盒说明采用微板法检测血清总胆固醇及总胆汁酸的含量.

1.4.6统计学方法

采用SPSS 22.0分析数据,使用t检验对2组之间的差异进行显著性评估,使用单因素方差分析(ANOVA)对2组以上的差异进行评估,然后采用Fisher′s LSD进行事后分析.P<0.05被认为是有统计学意义的.

2 结 果

2.1 加味丹栀逍遥散对CUMS小鼠行为学的影响

与正常组比较,模型组糖水偏好率明显降低(P<0.05),自主活动次数明显减少(P<0.05).与模型组相比,加味丹栀逍遥散与氟西汀组显著升高糖水偏好率(P<0.05),且明显增加小鼠的自主活动次数(P<0.05),见图1.

2.2 差异表达蛋白分析

使用Proteome Discoverer 2.1(Thermo Scientific)鉴定样本中所有的蛋白质.模型组和加味丹栀逍遥散组2组中所有蛋白质的火山图如图2所示.将差异倍数(FC)≥1.2或≤0.8,且P≤0.05 作为筛选标准,模型组和加味丹栀逍遥散组之间有20个差异表达蛋白,其中11个上调,9个下调(见表1).在附录图S1中,模型组和加味丹栀逍遥散组被清楚地分开,且重复性良好.

表1 加味丹栀逍遥散与模型组之间差异表达蛋白列表Tab. 1 List of DEPs between the modified Danzhi Xiaoyao San group and the model group

2.3 差异表达蛋白的生物信息学分析

GO富集分析显示,差异表达蛋白主要参与循环中免疫球蛋白复合物、多泡体、电压门控型钾离子通道复合物的细胞组成,分子功能主要是与免疫球蛋白受体、抗原结合,主要参与吞噬、抗体依赖性细胞毒性等生物过程(附录图S2).KEGG通路富集分析显示,模型组和加味丹栀逍遥散组之间差异表达蛋白主要富集到胆固醇代谢、初级胆汁酸生物合成、糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白的生物合成等途径(图3).

2.4 加味丹栀逍遥散对CUMS小鼠总胆固醇及总胆汁酸含量的影响

KEGG富集分析揭示CUMS小鼠差异表达蛋白与胆固醇代谢相关,为验证这一结果,检测了血浆中总胆固醇及其代谢主要产物胆汁酸的含量.生化检测结果显示,与正常组相比,模型组血浆总胆固醇含量显著降低(P<0.01),加味丹栀逍遥散给药后能显著升高其含量(P<0.05)(图4(a)).与正常组相比,模型组血浆总胆汁酸含量显著升高(P<0.05),与模型组相比,加味丹栀逍遥散组胆汁酸含量明显降低(P<0.01)(图4(b)).

3 讨 论

在郁证发病过程中,肝为起病之源,脑为传病之所;肝疏泄功能正常,则气机调畅,气血和调,心情开朗;肝失疏泄,气机逆乱,则肝气郁结,稍加刺激,即抑郁难解.因此,郁证的病变部位在脑,但关键病机在肝脏[14-15],故疏肝解郁为郁证的主要治则.

大量临床研究证实,通过治疗肝气郁结可有效缓解抑郁症[16-19],而疏肝解郁、肝脑同治抑郁症的物质基础目前尚知之甚少.本研究采用蛋白质组学方法观察了抑郁症模型小鼠及加味丹栀逍遥散给药后其肝脏蛋白质谱的变化情况.KEGG通路富集分析发现模型组和加味丹栀逍遥散组小鼠之间差异表达蛋白主要富集到胆固醇代谢及初级胆汁酸形成这些生化代谢途径.有研究显示在一些有抑郁症状[20-21]和严重抑郁症[22-23]患者中胆固醇含量较低,其代谢终产物胆汁酸可通过激活糖皮质激素受体(GR)来抑制下丘脑分泌促肾上腺皮质激素释放激素(CRH),抑制垂体分泌促肾上腺皮质激素(ACTH),从而维持HPA轴的稳态[24-27].另有研究表明抑郁状态大鼠“肠-肝-脑轴”内存在胆汁酸代谢障碍,胆汁酸受体FXR的水平升高;开心解郁丸可有效促进抑郁症大鼠的胆汁酸代谢,抑制胆汁酸FXR受体水平[28].靶向代谢组学研究发现抗抑郁药安郁沛勃胶囊影响初级胆汁酸的生物合成[29],抑郁模型小鼠海马中胆汁酸受体发生改变[30].本研究发现抑郁症模型小鼠血液中胆固醇含量降低,而其主要代谢产物总胆汁酸,含量明显增加.加味丹栀逍遥散给药后可逆转上述变化,具体为可上调总胆固醇含量而下调胆汁酸水平.

综上,研究表明加味丹栀逍遥散的抗抑郁机制可能与肝脏胆固醇代谢、胆汁酸合成相关,也为“肝气郁结”“肝脑同治”提供了一定的科学依据.至于抑郁症是如何影响胆固醇及胆汁酸代谢,加味丹栀逍遥散又是从何种途径调控而发挥抗抑郁作用的,有待进一步研究.

附录见电子版(DOI：10.16366/j.cnki.1000-2367.2023.03.03.0001).