加味沙参麦冬汤调控PTEN/PI3K/AKT 通路对CAG 大鼠的治疗作用

刘远婷，赵 磊，丁甜甜，李 慧，李国英

（1.新疆医科大学第七附属医院中医科，乌鲁木齐 832000；2.新疆医科大学校医院，乌鲁木齐 830011；3.新疆医科大学第七附属医院药学部，乌鲁木齐 832000）

慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）以胃黏膜腺体失去正常结构为特征，目前普遍认为CAG 为胃癌（gastric carcinoma，GC）的癌前病变之一[1]。CAG 发病期间可见上腹胀满、嗳气、食欲不振等不典型症状，患者往往不能及时发现和重视。随着病程的深入，可出现黏膜异型增生、肠上皮化生等病理性病变，癌变率约为 2.55%～7.46 %[2]。随着近年消化内镜检查的不断普及，CAG 检出率逐渐提升，约占胃镜检查人群的7.5%～13.8%[3]。胃黏膜细胞增殖和凋亡的紊乱为CG 演化进程中的早期事件，在CAG 的发生发展中发挥重要作用。第10 号 染 色 体 缺 失 的磷 酸 酶 和 张 力 蛋 白 同 源 物（PTEN）及磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT））信号通路参与细胞增殖、转化、凋亡及肿瘤发展的一系列过程，研究表明，PTEN的缺失可导致胃黏膜PI3K、AKT高表达，在正常胃组织-CAG 组织-GC 组织发展进程中，可见PI3K/AKT 通路逐渐被激活，从而抑制病变细胞凋亡[4-5]。大量临床报告证实[6-7]，中医药在治疗CAG 方面疗效较好，可有效改善CAG 临床症状，还可使黏膜萎缩状态得到不同程度的逆转，使治愈率显著提高。胃腑生理状态及功能的实现有赖于胃阴的濡润，且CAG 病程迁延，常见胃阴亏损之候，故多配以滋阴益胃中药。沙参麦冬汤有清养肺胃、生津润燥的功效，临床用于CAG 疗效良好[8]。本研究通过复制CAG 大鼠模型，观察加味沙参麦冬汤对细胞凋亡因子及PTEN/PI3K/AKT 信号转导通路的影响，探讨其对CAG 的作用及相关机制。

1 实验仪器与材料

1.1 动物 健康雄性Wistar 大鼠 60 只，SPF 级，体质量（160±20）g，分笼饲养于SPF 级动物房，饲养温度（22±2）℃，湿度40%～70%，保持12 h 光暗周期交替。实验动物许可证号：SYXK（新）2023-0004。

1.2 药物 维酶素片购自河北环海药业有限公司，规格：0.2 g。N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）购自美国 Fluka 公司，规格：5 g。加味沙参麦冬汤由新疆医科大学第七附属医院药剂室提供，组成如下：北沙参12 g，玉竹10 g，麦门冬10 g，生扁豆10 g，天花粉15 g，桑叶6 g，生甘草3 g，白芍10 g，木瓜10 g。

1.3 仪器与试剂 -80 ℃超低温冰箱（巨百生物有限公司）；Mirofuge 20 R 型低温高速离心机（美国Thermo Fisher）；BG-XM496 酶标仪（北京六一仪器厂）；RM 2235 全自动轮转式切片机，ChemTron KSW 正置光学显微镜，LEICA DM 2500 荧光相差显微镜（德国Leica公司）；Bio-Rad电泳仪（上海一恒科技有限公司）；Fluor Chem M 凝胶成像系统（广州施莱登生物科技公司）。Fas、FasL 大鼠ELISA 检测试剂盒购自上海酶科生物科技有限公司；TUNEL、DAPI 染色试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司 ；PTEN、PI3K、AKT 抗体试剂盒，DAB 显色剂购自武汉博士德公司；PTEN、PI3K、AKT 鼠单克隆抗体，兔GAPDH 多克隆抗体购自美国Abcam 公司。

2 实验方法

2.1 模型制备及干预 将60 只大鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、加味沙参麦冬汤低剂量、中剂量、高剂量组共6 组，每组各10 只。除空白组外，其余大鼠采用MNNG 自由饮用法复制CAG 模型[9]：取MNNG 粉末充分溶解于蒸馏水，配制为浓度170 mg/L的溶液灌于避光饮水瓶，每日更换瓶中溶液，大鼠自由饮用8 周，造模完成后行胃黏膜HE 染色，以黏膜腺体数减少、固有腺体萎缩等改变为模型成功标准。阳性对照组以维酶素为阳性对照[10]，给予0.3 g/kg 维酶素混悬液灌胃，每日1 次，持续12 周；加味沙参麦冬汤低、中、高剂量分别给予加味沙参麦冬汤不同剂量灌胃（4.84、9.68、19.35 g/kg），每日1 次，持续12 周。

2.2 胃黏膜血流量（GMBF）测定 测试前大鼠禁食24 h，腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉后取尾静脉血1 mL，置于抗凝管中，开腹分离右侧股静脉、股动脉，由股静脉穿刺注入中性红生理盐水溶液，先以4 mg/kg速度注入0.5 %中性红溶液，输注2 mL 后，以微量注射泵注入0.05 %溶液维持，每隔15 min 收集1 次胃液，2 h 后心脏穿刺取血4 mL，分光光度计法于540 nm波长下比色，得出血液、胃液内中性红浓度并计算GMBF。GMBF =胃液中性红浓度/血液中性红浓度×单位时间内胃液分泌量。

2.3 ELISA 实验检测血清中Fas、FasL 含量 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉后解剖，经腹主动脉采血后处死，离心后收集上清，按ELISA 试剂盒操作步骤检测血清中Fas、FasL 的含量：反应孔中加入酶标抗体100 μL、稀释剂40 μL 和血清样品10 μL，同时做空白孔及阴性对照孔，于37℃温箱反应1 h 后洗涤，加入临时配制的显色剂100 μL，37℃避光15 min 后终止反应，于酶标检测仪450 nm波长处测定OD 值，以OD 值为纵坐标，标准品浓度为横坐标绘制标准曲线，根据样品OD 值代入曲线求Fas、FasL 的相应浓度。

2.4 TUNEL 染色检测胃黏膜上皮细胞凋亡 大鼠采血处死后立即取材，取部分胃黏膜组织放入10%多聚甲醛溶液中固定24 h，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，液体石蜡中包埋后作5 μm 厚切片，切片脱蜡至水，EDTA 修复液 98 ℃ 抗原修复，加入蛋白酶K 工作液于37 ℃孵育18 min，TUNEL 反应液37 ℃反应1 h，加入终止液室温处理15 min 后，滴加DAPI 衬染细胞核，滴加抗荧光催灭剂，荧光显微镜下观察凋亡细胞并拍照，随机选取5 个视野，Image J 软件分析平均光密度值。

2.5 免疫组织化学法检测胃黏膜PTEN、PI3K、AKT的阳性表达 取部分胃黏膜组织放入10%多聚甲醛溶液中固定24 h，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，液体石蜡中包埋后作5 μm 厚切片，切片脱蜡至水，加入H2O2室温封闭10 min，置于抗原修复液中热修复，滴加5% BSA 封闭20 min，滴加一抗后于4℃过夜，滴加二抗于37℃反应20 min，滴加SABC 于37℃反应20 min，加入DAB 显色，自来水冲洗后中性树胶封片，光学显微镜下观察阳性细胞表达并拍照，随机选取5个视野，Image J 软件分析平均光密度值。

2.6 Western-blot 检测胃黏膜PTEN、PI3K、AKT 的蛋白表达 取大鼠胃黏膜组织100 mg，加入RIPA裂解液，12 000 rpm，4℃离心30 min 后取裂解上清，BCA 法于562 nm 波长处进行蛋白定量，加入Loading buffer 稀释浓度，制胶后各组取10 μL样品进行电泳、转膜，滴加5%TBST 脱脂奶粉封闭液室温2 h，加入一抗（1:1 000）置于4℃过夜，加二抗（1:5 000）室温反应1 h，ECL显色，凝胶图像分析系统拍照，采用Image J 软件对蛋白条带进行定量分析，以GAPDH 为内参，分别计算PTEN、PI3K、AKT 的相对表达量。

2.7 统计学方法 使用SPSS 20.0软件进行数据分析，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用t检验，以GraphPad Prism 5.0 软件绘制柱状图，结果以均数±标准差 （±s）表示，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 加味沙参麦冬汤对胃黏膜血流量的影响 与空白组比较，模型组胃黏膜血流量明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，经加味沙参麦冬汤低、中、高不同剂量组灌胃治疗后，胃黏膜血流量随着给药剂量的升高逐渐提升（P＜0.05），见表1。

表1 各组大鼠胃黏膜血流量（± s，n = 10） mg/（kg.hr）

表1 各组大鼠胃黏膜血流量（± s，n = 10） mg/（kg.hr）

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

组别 GMBF空白组 26.35±3.93模型组 10.87±4.46#阳性对照组 19.75±3.26△加味沙参麦冬汤低剂量组 15.34±5.12△加味沙参麦冬汤中剂量组 17.88±3.19△加味沙参麦冬汤高剂量组 23.13±4.58△

3.2 加味沙参麦冬汤对血清Fas、FasL 表达的影响 ELISA 结果可见，模型组血清中Fas、FasL 的浓度较空白组明显升高（P＜0.05）；与模型组相比，经加味沙参麦冬汤低、中、高不同剂量组灌胃治疗后，血清Fas、FasL 的浓度随着给药剂量的升高逐渐降低（P＜0.05），见表2。

表2 各组大鼠血清Fas、FasL 水平（± s，n = 10） pg/mg

表2 各组大鼠血清Fas、FasL 水平（± s，n = 10） pg/mg

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

组别 Fas FasL空白组 942.01±249.76 59.37±16.94模型组 3 024.88±142.40# 844.09±37.76#阳性对照组 901.81±88.76△ 353.97±53.53△加味沙参麦冬汤低剂量组1 703.50±120.29△ 572.45±97.45△加味沙参麦冬汤中剂量组 915.21±78.97△ 401.99±60.65△加味沙参麦冬汤高剂量组 524.86±73.12△ 158.05±23.82△

3.3 加味沙参麦冬汤对胃黏膜细胞凋亡的影响 TUNEL 染色显示，TUNEL 标记的细胞呈现绿色荧光，DAPI 阴性复染的细胞核呈现蓝色荧光，模型组胃黏膜见较多绿色荧光细胞核，数量高于空白组（P＜0.05）；与模型组相比，经加味沙参麦冬汤低、中、高不同剂量组灌胃治疗后，绿色荧光细胞核数量随着给药剂量的升高逐渐降低（P＜0.05），如图1，见表3。

图1 各组大鼠胃黏膜细胞凋亡情况（TUNEL，×200）

表3 各组大鼠胃黏膜细胞凋亡情况（± s，n = 10）

表3 各组大鼠胃黏膜细胞凋亡情况（± s，n = 10）

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

组别 MD 值空白组 5.11±1.33模型组 19.95±3.02#阳性对照组 10.52±1.59△加味沙参麦冬汤低剂量组 15.29±1.88△加味沙参麦冬汤中剂量组 12.26±2.07△加味沙参麦冬汤高剂量组 7.87±1.32△

3.4 加味沙参麦冬汤对胃黏膜PTEN、PI3K、AKT 阳性表达的影响 IHC 结果显示，空白组胃黏膜可见较多PTEN 阳性表达，仅见少量PI3K、AKT 的阳性表达，与空白组比较，模型组胃黏膜中PTEN 的阳性表达量明显减少，PI3K、AKT 的阳性表达量明显增多（P＜0.05）；与模型组相比，经加味沙参麦冬汤低、中、高不同剂量组灌胃治疗后，PTEN 的阳性表达量随着给药剂量的升高逐渐增多，PI3K、AKT 的阳性表达量逐渐减少（P＜0.05），如图2，表4 所示。

图2 各组大鼠胃黏膜组织PTEN、PI3K、AKT 的阳性表达（IHC，×200）

表4 各组大鼠胃黏膜组织PTEN、PI3K、AKT 阳性表达（± s，n = 10） MOD 值

表4 各组大鼠胃黏膜组织PTEN、PI3K、AKT 阳性表达（± s，n = 10） MOD 值

注：与空白组比较，# P ＜0.05；与模型组比较，△P ＜0.05

组别 PTEN PI3K AKT空白组 0.43±0.07 0.25±0.05 0.28±0.03模型组 0.16±0.06# 0.49±0.04# 0.55±0.04#阳性对照组 0.31±0.05△0.32±0.08△0.34±0.05△加味沙参麦冬汤低剂量组0.24±0.09△0.40±0.04△0.42±0.06△加味沙参麦冬汤中剂量组0.29±0.07△0.36±0.06△0.38±0.05△加味沙参麦冬汤高剂量组0.39±0.06△0.29±0.03△0.31±0.06△

3.5 加味沙参麦冬汤对胃黏膜PTEN/PI3K/AKT 通路蛋白的影响 与空白组比较，模型组胃黏膜组织中PTEN 的蛋白表达明显减少，PI3K、AKT 的蛋白表达明显增多（P＜0.05）；与模型组相比，经加味沙参麦冬汤低、中、高不同剂量组灌胃治疗后，AKT 的蛋白表达随着给药剂量的升高逐渐减少（P＜0.05）；低剂量组PTEN、PI3K 的蛋白表达量较模型组有所改善，但差异无统计学意义（P＞0.05），中剂量、高剂量组PTEN 的蛋白表达较模型组明显增多，PI3K 的蛋白表达较模型组明显减少（P＜0.05），如图3 所示。

图3 各组大鼠胃黏膜组织PTEN/PI3K/AKT 通路蛋白表达

4 讨论

中医学将CAG 归属于“胃脘痛”“痞满”“胃萎”等范畴，认为其病性属虚实并见，以虚为本。脾胃虚弱，升降运化无力，招致外邪侵扰，或形成气滞、食积、湿浊、瘀血，实邪内阻，使虚者愈虚，日久则郁热伤阴，见胃阴亏损，胃络失和，胃体萎弱之征。胃为阳土，喜润而恶燥，津液充盈胃方能受纳五味而降浊。本病起病隐袭，病程迁延，日久则郁热伤阴，常见胃阴亏损之候，治宜滋阴益胃，益气健脾[11]。沙参麦冬汤为吴鞠通《温病条辨》中清养肺胃、生津润燥的代表方[12]，全方由沙参、麦冬、玉竹、冬桑叶、扁豆、天花粉、甘草组成，本人在临床上应用沙参麦冬汤加味，在原方基础上加用白芍、木瓜，用于CAG 效果显著。方中北沙参、麦门冬相伍甘凉濡润，入胃以养阴，为君药；玉竹、天花粉清热兼以养阴，二药合用使沙参、麦冬滋阴之力倍增，为臣药；桑叶滋阴润燥，白扁豆补中培土、益气化湿，以防滋阴之品助湿生满，白芍、木瓜舒肝和胃、敛阴生津，共为佐药；甘草为使，调和诸药，与白芍、木瓜酸味之品同用，酸甘合法，二济其阴，起到激活胃腺，增加胃液作用。

多数研究证明[13-14]，胃黏膜上皮细胞增殖和凋亡的紊乱与CAG 的发病和进展密切相关。CAG 胃黏膜在慢性炎症刺激下细胞不稳定性增加，出现大量凋亡及异常活跃的增殖细胞，细胞增殖和凋亡指数随黏膜萎缩程度的加重逐渐增加；在CAG 伴肠化生阶段，发生细胞凋亡障碍，增殖细胞持续增加，进而出现不典型增生[15]。胃黏膜细胞增殖凋亡及腺体萎缩受EGFR/PI3K/AKT信号通路的调控，表皮生长因子受体（EGFR）与其受体在细胞膜上结合，在CAG 胃黏膜中出现不同程度的高表达和激活，引起黏膜上皮细胞分化和增殖活跃，随后通过激活其下游PI3K/AKT 信号实现对细胞凋亡的调节[16-17]。活化的PI3K 能够将磷酸化磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）催化为磷脂酰肌醇三磷酸（PIP3），PIP3 激活AKT，AKT 由胞质转至胞膜，通过下游多种效应因子抑制细胞凋亡[18]。磷酸酯酶和张力蛋白同源基因（PTEN）是一种抑癌基因，可通过下调PIP3水平对细胞内PI3K/AKT 信号进行负性调控，PTEN的失活可促使PIP3 积聚，从而增强AKT 活化[19]。在CAG 到GC 的病理进展中，黏膜组织PTEN 的表达量随病情的加重而减少[20]。

团队前期研究证实[21]，加味沙参麦冬汤灌胃干预可增强CAG 大鼠黏膜上皮保护功能，改善黏膜病理损伤，在分子层面，其作用后抑制了EGFR 通路表达水平，进而减轻上皮细胞的异常增殖。本研究中，模型组胃黏膜凋亡阳性细胞数增加，血清中促凋亡分子Fas及其配体FasL 的水平显著升高，提示CAG 大鼠细胞凋亡与增殖水平同时升高，经加味沙参麦冬汤治疗后，胃黏膜凋亡细胞明显减少，血清中Fas、FasL 的水平显著降低，表明加味沙参麦冬汤对CAG 凋亡和增殖均有改善作用，可通过抑制细胞过度凋亡，从而改善黏膜萎缩状态。检测PTEN/PI3K/AKT 通路蛋白发现，模型组胃黏膜PTEN 表达水平明显降低，PI3K、AKT 的表达明显增高，加味沙参麦冬汤治疗后增加了PTEN的表达，抑制了PI3K、AKT 的水平，提示加味沙参麦冬汤可通过上调PTEN 表达抑制病变组织PI3K/AKT通路的过度激活。

综上所述，加味沙参麦冬汤对MNNG 所诱导的CAG 大鼠具有明显疗效，可通过减轻上皮细胞过度凋亡，维护黏膜损伤过程中凋亡与增殖的平衡达到胃黏膜保护效果，并可通过促进抑癌基因PTEN 的表达抑制PI3K/AKT 通路活性，进而在延缓萎缩病变组织炎-癌转变中发挥作用。