健脾化瘀解毒法对结肠癌裸鼠模型癌及癌旁组织中AKT、mTOR、p-4EBP1 表达的影响研究

宁康文，简小兰， 曾普华，邝婉婷，杨家翔，周婉双，刘 伟，兰东强

（1.湖南中医药大学研究生院，长沙 410208；2.湖南省中医药研究院附属医院，长沙 410006）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）作为一种全球性疾病，在我国是发病率很广、死亡率极高的恶性肿瘤[1]。随着新时期的到来，中国结直肠癌的发病率和死亡率也逐年上升，在全国癌症发病率和死亡率中分别排名第三及第四位[2]。而在大肠癌患者中，术后复发和转移是其死亡的首要因素，据保守估计，对于早中期结直肠癌进行了根治性切除，5%的I 期患者会复发，II 期患者的复发率为10%～20%，III 期患者的复发率为30%～45%[3]。现下中医药抗肿瘤技术快速发展，中医药治疗恶性肿瘤及抗复发转移效果明显。

“瘀”“毒”“虚”是名中医蒋益兰教授结合临床经验总结的肠癌基本病机，蒋教授认为肠癌术后复发转移主要责之于瘀毒未尽且正气亏虚、脾土不足，并以健脾化瘀解毒法作为临床辨治肠癌的主要治法[4]，其临床疗效及抗癌机制已在许多临床及动物实验中被验证。临床研究发现健脾化瘀解毒法在防治结直肠癌复发与转移方面发挥了良好作用，它能拮抗肠癌术后复发及转移，延长生存期，能稳定瘤体，提高患者生活质量[5-6]，实验研究发现其还可以降低VEGF 表达，抑制肿瘤血管生成[7]。AKT/mTOR 是调节肿瘤生长、增殖的重要信号途径，其异常激活与肿瘤的发生、发展密切相关[8]。研究团队前期研究发现健脾化瘀解毒法能通过对mTOR 信号途径的抑制而起到抗肿瘤的作用[9]，但其抗肿瘤机制研究仍有待进一步深入探索，以及进一步研究抗结直肠癌复发转移不同治法中药如何发挥作用。

本文在前期研究基础上，构建了结肠癌裸鼠模型，拆分健脾化瘀解毒各治法干预，观察各组对结肠癌裸鼠模型AKT、 mTOR、p-4EBP1 表达的影响，以进一步探索健脾化瘀解毒治法抗肠癌的可能作用机制，为其进一步推广提供论证。

1 材料

1.1 细胞系、实验动物 购于中国科学院细胞库的人类结肠癌细胞系HCT116 细胞（TCHU99）。SPF 级裸鼠60 只，BALB/C-nu/nu，雌雄各半，体质量（20±2）g，购于湖南长沙斯莱克景达实验动物有限公司（合格证号：43004700026556）。本研究在SPF 环境下进行，并经过湖南省中医药研究院实验动物伦理委员会同意。

1.2 主要试剂与仪器 培养基DMEM 购于Hyclone 公司。10%胎牛血清购于Biological Industries 公司（批号：1616316）。细胞培养箱购自Thermo 公司（型号：HERAcell2401）。AKT（Y89， 批 号 为ab32505），mTOR（Y391，批号为ab32028），p-4EBP1（phospho T37，批号为ab75767，均从美国Abcam 公司购得。5-氟尿嘧啶（5-Fu）（规格10 mL：0.25 g，批号：6927924804023）购买于旭东海普，雷帕霉素购买于Calbiochem 公司。

1.3 中药制备 健脾益气组：人参10 g，薏苡仁30 g；化瘀解毒组：半枝莲30 g，重楼10 g，莪术10 g，郁金15 g；健脾化瘀解毒组：人参15 g，薏苡仁30 g，半枝莲30 g，重楼10 g，莪术10 g，郁金15 g。上述中药饮片均于湖南省中医药研究院附属医院门诊中药房购得，均属于一级药材，符合《中华人民共和国药典》（2020 年版）规定。配制中药煎剂，按照以上剂量配比，按处方用量，用10 倍的清水浸泡30 min，煎煮60 min，分离药渣，储存药液。再加8 倍的清水浸泡30 min，煎煮60 min，分离药渣，储存药液。将2次药液混合均匀，浓缩至1.5 g/mL，过滤、除菌后，封于4 ℃冰箱冷藏。

2 方法

2.1 制备瘤源 以胎牛血清、DMEM 培养基为原料，体外培养HCT116 结肠癌细胞。HCT116 结肠癌细胞长至培养皿底80%～90%时，加入适量胰蛋白酶，2 ～3天换液1 次，3 ～4 d 传代1 次。取处于对数生长期且离心后的HCT116 细胞悬液，按照2×107/mL 的浓度，每只BALB/C-nu/nu 裸鼠右腋下注射0.1 mL（接种细胞数即2×106个），共注射10 只，观察裸鼠腋下种植瘤生长，将长出直径1cm 左右的实体瘤，断颈处死小鼠后解剖提取其中的肿瘤组织，取肿瘤中心处生长良好的组织，作为原位移植瘤的瘤源，按照1 mm3大小剪碎组织备用。

2.2 建立裸鼠结肠癌模型 SPF 裸鼠在无菌环境（实室提前紫外线消毒灭菌2 h）下用10%的水合氯醛（40 mg/kg）腹腔注射麻醉裸鼠。2 ～3 min 后在裸鼠腹部左下侧2.5 cm 处切开腹腔， 寻找并暴露盲肠，用l mL 小针头轻轻将盲结肠交界处浆膜刮破，稍有渗出血液，将1 mm3大小肿瘤碎块种植于盲结肠交界处浆膜层，使用OB 胶黏贴。植入完成后，用3%碘酊消毒裸鼠腹腔，将盲肠送入腹腔，缝合。2 周后，裸鼠腹部均可用手触及明显肿块，提示造模成功。

2.3 裸鼠分组与给药 将造模成功的30 只裸鼠，随机分为模型组、健脾益气组、化瘀解毒组、健脾化瘀解毒组、雷帕霉素组和5-Fu 组，每组5 只。另取5 只未予任何处理的小鼠为空白对照组。模型组与空白组予每只0.2 mL 生理盐水灌胃，1 天1 次，每周给药5 天，持续4 周。中药各组予15 g/kg （约每只0.2 mL）中药液灌胃给药，给药结束后均予0.2 mL/只生理盐水灌胃，频次同模型组。雷帕霉素组行1 mg/kg（约0.02 mg）腹腔注射，5-Fu 组按人腹腔给药550 mg/m2折算为每周3.7 mg（约0.15 mL），均为每周2 次，均予生理盐水灌胃，次数与剂量同模型组。

2.4 取材 在最后一次给药注射后，断颈处死小鼠，无菌环境下解剖开腹，将瘤体完全剥除，并取适量的瘤旁组织。空白组取相应部位结肠组织。

2.5 免疫组化法检测肿瘤组织AKT、mTOR、p-4EBP1的表达 应用SP 二步法进行免疫组织化学染色，用已知的结肠癌肿瘤组织阳性片作为阳性对照，以PBS 取代一抗作为阴性对照，使用DAB 显色，封片。每组随机抽取5例标本，每例标本随机选取6个视野（×400），在病理分析系统中选择图像最清晰的区域，进行尺度调整和光密度校正。在每个图像中，随机选择一个被测量的对象区域，利用体视学的基本原理，实现单点彩色分割，得到各组平均光密度（MOD），进行统计学分析。

2.6 统计学方法 采用SPSS 27.0 进行数据分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD 检验，以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 肿瘤组织中AKT、mTOR、p-4EBP1 的表达 AKT阳性物质表现为褐色及黄色的微粒（图1 ～图2），其主要存在于细胞浆中，少数位于细胞膜上，而阴性对照组呈淡黄色。mTOR 阳性物质呈深褐色或深黄色颗粒（图3 ～图4），其分布在细胞胞质及细胞核中，少数位于细胞膜中，阴性则表现为浅黄色。p-4EBP1的阳性物质表现为褐色或深黄色的微粒（图5 ～图6），其分布在细胞浆及细胞膜上，阴性表现为无色或淡黄色。

图1 ～图2 AKT（免疫组织化学染色，×400）

图3 ～图4 mTOR（免疫组织化学染色，×400）

图5 ～图6 p-4EBP1（免疫组织化学染色，×400）

3.2 模型组AKT、mTOR、p-4EBP1 蛋白的表达与空白组比较 与空白组相比，模型组癌组织与癌旁组织中AKT、mTOR、p-4EBP1 的表达均升高（P＜0.05），且AKT、mTOR、p-4EBP1 的表达水平均为癌组织＞癌旁组织＞正常肠黏膜组织。见表1。

表1 模型组与空白组各蛋白表达（± s，n = 5）

表1 模型组与空白组各蛋白表达（± s，n = 5）

注：与空白组比较，# P ＜0.05

组别 组织类型 AKT mTOR p-4EBP1空白组 —— 0.22±0.13 0.31±0.10 0.26±0.13模型组 癌组织 0.46±0.15# 0.59±0.11# 0.62±0.16#癌旁组织 0.39±0.06# 0.48±0.08# 0.57±0.19#

3.3 各组裸鼠AKT蛋白的表达与模型组的比较 与模型组比较，健脾益气组、化瘀解毒组、健脾化瘀解毒组、雷帕霉素组、5-Fu 组癌组织与癌旁组织中，AKT蛋白的表达均呈下降水平（P＜0.05），其中以健脾益气组与健脾化瘀解毒组降低最为明显（P＜0.05）。对于AKT 蛋白降低水平，健脾益气组＜健脾化瘀解毒组，健脾益气组与健脾化瘀解毒组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。与雷帕霉素组及5-Fu 组比较，健脾化瘀解毒组对AKT 蛋白表达水平下降，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组癌及癌旁组织AKT 表达的比较（± s，n = 5）

表2 各组癌及癌旁组织AKT 表达的比较（± s，n = 5）

注：与模型组比较，# P ＜0.05，## P ＜ 0.01；与健脾益气组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01；与化瘀解毒组比较，▲P ＜0.05，▲▲P＜0.01；与雷帕霉素组比较，□P ＜0.05；与5-Fu 组比较，■P ＜0.05

组别 癌组织 癌旁组织模型组 0.46±0.14 0.39±0.05健脾益气组 0.28±0.05##□ 0.24±0.13#▲▲化瘀解毒组 0.31±0.13#□ 0.34±0.08#□健脾化瘀解毒组 0.16±0.10##△△▲□■ 0.22±0.07##▲▲□■雷帕霉素组 0.30±0.15##△ 0.25±0.17#5-Fu 组 0.27±0.16# 0.29±0.15#△

3.4 各组裸鼠mTOR 蛋白的表达与模型组的比较 与模型组比较，健脾益气组、化瘀解毒组、健脾化瘀解毒组、雷帕霉素组、5-Fu 组癌组织与癌旁组织中，mTOR蛋白表达均下降，差异有统计学意义（P＜0.05），5 组中以健脾化瘀解毒组和雷帕霉素组mTOR 的下降最低，以健脾化瘀解毒组下降最明显（P＜0.05）。化瘀解毒组mTOR 表达水平较健脾益气组、5-Fu 组癌组织与癌旁组织低（P＜0.05）。健脾益气组癌组织及癌旁组织中mTOR 表达与化瘀解毒组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

与健脾益气组、化瘀解毒组、5-Fu 组癌组织与癌旁组织比较，健脾化瘀解毒组对mTOR 表达的下降差异有显著性差异（P＜0.05）。雷帕霉素组与健脾化瘀解毒组癌组织与癌旁组织比较，对mTOR 表达的下降无显著性差异（P＞0.05）。雷帕霉素组与健脾益气组、化瘀解毒组癌组织及癌旁组织比较，对mTOR 表达的下降结果有显著性差异（P＜0.05）。见表3。

表3 各组癌及癌旁组织mTOR 表达的比较（± s，n = 5）

表3 各组癌及癌旁组织mTOR 表达的比较（± s，n = 5）

注：与模型组比较，# P ＜0.05，## P ＜ 0.01；与健脾益气组比较，△P ＜0.05；与化瘀解毒组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；与5-Fu组比较，■P ＜0.05

组别 癌组织 癌旁组织模型组 0.59±0.15 0.51±0.06健脾益气组 0.42±0.07# 0.48±0.12#▲化瘀解毒组 0.39±0.13# 0.29±0.04##健脾化瘀解毒组 0.25±0.09##△▲■ 0.22±0.03#△▲▲■雷帕霉素组 0.27±0.07#△▲ 0.24±0.08#△▲5-Fu 组 0.45±0.16#▲ 0.36±0.09#▲

3.5 各组裸鼠p-4EBP1 蛋白的表达与模型组的比较 与模型组比较，健脾益气组、化瘀解毒组、健脾化瘀解毒组、雷帕霉素组、5-Fu 组癌组织与癌旁组织中p-4EBP1 的表达均有降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。以健脾化瘀解毒组和雷帕霉素组p-4EBP1 的表达水平最低，而健脾化瘀解毒组下降幅度最为明显（P＜0.05）。在健脾益气组及化瘀解毒组中，p-4EBP1表达水平较5-Fu 组癌组织中低（P＜0.05）。健脾益气组与化瘀解毒组癌组织与癌旁组织中p-4EBP1 表达相比差异无显著性意义（P＞0.05）。健脾益气组、化瘀解毒组、雷帕霉素组、5-Fu 组与健脾化瘀解毒组癌组织及癌旁组织比较，p-4EBP1 的下调差异均有显著性差异（P＜0.05）。见表4。

表4 各组癌及癌旁组织p-4EBP1 表达的比较（± s，n = 5）

表4 各组癌及癌旁组织p-4EBP1 表达的比较（± s，n = 5）

注：与模型组比较，# P ＜0.05，## P ＜ 0.01；与健脾益气组比较，△P ＜0.05；与化瘀解毒组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01；与雷帕霉素组比较，□P ＜0.05；与5-Fu 组比较，■P ＜0.05

组别 癌组织 癌旁组织模型组 0.62±0.14 0.57±0.12健脾益气组 0.26±0.04## 0.41±0.11#□化瘀解毒组 0.27±0.05##□ 0.45±0.13#健脾化瘀解毒组 0.18±0.04#△▲▲□■ 0.23±0.10##△▲□■雷帕霉素组 0.21±0.03# 0.36±0.07#5-Fu 组 0.42±0.13#△▲ 0.38±0.05#△

4 讨论

Akt/mTOR 是一种广泛存在于细胞中的信号途径，参与多种恶性肿瘤[10-11]发生、侵袭和转移。Akt 可与PIP2 和PIP3 反应，激活 Akt 从细胞质进入细胞膜，进而激活其下游的靶标，促进细胞生长，抑制细胞凋亡[12]。AKT 在组织内分布广泛，它对肿瘤细胞的异常活化有促进作用。现有研究证明，AKT 在大肠癌[13]的发展过程中，激活了细胞的存活信号，并通过磷酸化的方式激活AKT，抑制了其下游的多种活性物质，从而抑制癌细胞的凋亡，促进癌细胞的生长、增殖和分化。mTOR 是PI3K/Akt 途径的下游分子，在正常情况下，通过Akt 介导后，mTOR 被激活，进而磷酸化4EBP1来调控细胞的生长与增殖[14]。p-4EBP1 是mTOR 的下游分子，曹李等发现p-mTOR 与p-4EBP1 在大肠癌中的表达存在显著的正相关关性（P＜0.0.5），而p-mTOR、p-4EBP1 在大肠癌中的高表达水平可能是导致结直肠腺癌发病的主要机制之一[15]。

本实验结果表明，健脾化瘀解毒组对大肠癌HCT116 裸鼠模型癌组织与癌旁组织中的AKT、mTOR、p-4EBP1 的表达均有一定的抑制作用。健脾益气组和化瘀解毒组对癌组织与癌旁组织中AKT、mTOR、p-4EBP1 的表达均有一定的下调作用，但其下降幅度低于健脾化瘀解毒组。

结直肠癌中医学里称为“肠覃、脏毒、肠癖”等，根据多年行医经验，蒋老师认为大肠癌病因主要分为内因及外因[16]，内因责之于人体正气亏虚，又以脾气虚为主，外因包括外感六淫之邪、饮食失节等。当人体长期处于正气亏虚的状态，以致于不能有效抵御外邪，从而导致有形之邪如食滞、气阻、血瘀、痰凝、湿聚等瘀滞体内， 久而不散， 日久搏结，积聚以化毒，发展成为癌块。概括以脾气亏虚、癌毒内结，即病机以瘀、毒、虚为本，临床治疗当以健脾益气，化瘀解毒为治法。基于此治法我们拟方健脾消癌方，核心药物由人参 10 g，薏苡仁 30 g，半枝莲 30 g，重楼 10 g，莪术 10 g，郁金 15 g 组成，方中人参、薏苡仁健脾益气，重楼、半枝莲清热解毒，莪术、郁金活血化瘀消癥，全方合用，既能健脾益气扶正，又可化瘀解毒攻邪，攻补兼施。

结果表明健脾化瘀解毒组可能通过抑制Akt/mTOR通路的激活，下调AKT、mTOR、p-4EBP1 蛋白的表达，从而达到抗癌、抑癌、阻癌的目的，且健脾化瘀解毒法优于单纯的健脾益气法及化瘀解毒法。脾胃为气血生化之源、后天之本。化瘀解毒药物多寒凉、辛散，久用则有易伤脾胃、耗散气血、损伤正气之弊端。健脾化瘀解毒治法合健脾益气、化瘀解毒，一方面可以固护脾胃，保养后天之气血，弥补化瘀解毒药物易伤人体正气的缺陷，从而抑瘤而无后顾之忧；另一方面又可正面奋起抗邪，攻毒抑瘤、消痈散结，发挥抗癌作用；故整体配伍、协同增效、疗效最佳。

综上，健脾化瘀解毒法的抗肿瘤机制可能系下调Akt/mTOR 通路的关键蛋白AKT、mTOR、p-4EBP1 的表达，健脾益气法与化瘀解毒法协同增效，以获得最佳疗效。但中医药具有多靶点作用，常常通过多种途径发挥抗肠癌效应，其作用机理还需深入探讨。