分裂相关增强子1、细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C在直肠癌组织中的表达及其临床意义

张景旭, 李德舫, 于 渌, 张玉田

(承德市中医院肿瘤科, 河北 承德 067000)

直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一,发病率呈逐年上升趋势[1]。细胞分裂周期蛋白25同源蛋白C(Cell division cycle 25C,CDC25C)和分裂相关增强子1(Hairy and enhancer of split related protein 1,HESR-1)是与细胞分裂和肿瘤发生密切相关的关键基因。细胞周期包括G1期、S期、G2期和M期4个阶段[2-3],CDC25C是磷酸酶家族成员,主要负责细胞在细胞周期进程中G2期到M期的转换[4-5]。CDC25C过度表达与肿瘤进展及不良预后有关[2]。与CDC25C类似,HESR-1也是一个与细胞分裂和肿瘤相关的关键基因,参与调控胚胎早期发育以及成人器官的生长和再生[6]。既往研究发现,HESR-1在多种肿瘤中的表达异常,并与肿瘤的发生和发展有关[7-8]。本研究分析CDC25C和HESR-1在直肠癌中的表达及其与预后的关系,以期寻找直肠癌潜在诊治靶点。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2016年1月至2022年1月承德市中医院肿瘤科收治的直肠癌患者为研究对象。纳入标准:(1)病理检查确诊为直肠癌。(2)病理分期Ⅰ～Ⅲ期。(3)首次诊断并接受根治性直肠癌切除术。(4)临床资料及随访资料完整。排除标准:(1)肿瘤远处转移。(2)术前接受新辅助化疗、靶向治疗等。(3)院内死亡。最终166例患者被纳入研究,其中,男性109例,女性57例;初诊年龄33～73岁,平均年龄(56.5±8.7)岁。患者组织样本保存于承德市中医院病理科。通过电子病历系统收集患者的资料,包括年龄、性别、治疗策略、随访资料、术后生存资料和治疗反应记录。

1.2 免疫组织化学染色及评分对组织样本进行石蜡包埋,制成5 μm切片。将组织切片在65℃的烤箱中加热60 min,二甲苯脱蜡,梯度乙醇中脱水。在高压锅中进行高沸点抗原回收,PBS缓冲液清洗3次,每次5 min。切片在室温下用3%过氧化氢处理20 min,PBS冲洗3次,再用5%正常山羊血清封闭。将切片与CDC25C一抗(稀释1∶100),HESR-1一抗(稀释1∶100)在4℃℃条件下共同孵育过夜。次日,PBS冲洗3次,与用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育30 min。切片用盐酸二氨基联苯胺(DAB)溶液孵育3 min,苏木精染色,在光学显微镜下观察。采用半定量法对染色结果进行评估,在400倍放大条件下,选取5个随机视野进行结果判读。染色强度评定为:未染色(0分)、浅棕色(1分)、棕黄色(2分)、深棕色(3分)。阳性细胞的百分比为:阳性细胞≤5%(0分)、6 ～25%(1分)、26～ 50%(2分)、≥75%(3分)。评定标准:0～1分,阴性(-);2～3分,弱阳性(+);4～6分,中等阳性(++);7～9 分,强阳性(+++)。

1.3 实时荧光定量 PCR(RT-qPCR)检测检测40例癌组织及配对癌组织中CDC25C mRNA与HESR-1 mRNA表达水平。使用RNA提取试剂盒从组织中提取总RNA;随后使用PrimeScriPt RT Master Mix (TaKaRa, Osaka, Japan)和SYBR PremiexExTaq试剂盒(TaKaRa, Osaka, Japan)将总RNA反向转录为cDNA后进行扩增。以GAPDH为内参基因,采用2-ΔΔCt方法计算mRNA的相对表达量。基因引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 蛋白质印迹法(Western blot)检测检测8例癌组织及配对癌组织中CDC25C与HESR-1蛋白表达水平。向组织中加入细胞裂解液,随后将细胞裂解产物在4℃,14 000 r/min,离心15 min,收集上清,使用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。将提取的蛋白质进行SDS-PAGE电泳后转移到PVDF膜上。将PVDF膜在5%脱脂牛奶浸泡2 h,阻断非特异性结合位点。将膜与一抗CDC25C(1∶1 000稀释)、HESR-1(1∶1 000稀释)在4℃下共同孵育过夜。洗涤后,将膜与相应的过氧化物酶偶联二抗共同孵育2 h,使用增强型化学发光检测系统检测条带。以GAPDH作为内参对照。

2 结果

2.1 免疫组织化学染色检测直肠癌组织中CDC25C与HESR-1的表达肠癌组织中CDC25C、HESR-1的阳性率均高于癌旁组织[46.9%(78/166)vs12.6%(21/166), 41.6% (69/166)vs7.6%(15/166)],差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 免疫组化染色检测直肠癌组织中CDC25C与HESR-1的表达

2.2 RT-qPCR及Western Blot检测直肠癌组织中CDC25C与HESR-1的表达癌组织CDC25C mRNA与HESR-1 mRNA的相对表达量分别为(3.89±1.01)、(7.10±1.38),均高于癌旁组织的(2.17±0.82)、(3.46±1.12),差异均有统计学意义(P<0.05);癌组织CDC25C与HESR-1蛋白表达水平分别为(3.25±0.76)、(4.19±1.01),均高于癌旁组织的(0.81±0.18)、(0.89±0.11),差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注: A, RT-qPCR检测直肠癌组织中CDC25C与HESR-1的表达; B, Western Blot检测直肠癌组织中CDC25C与HESR-1的表达。

2.3 直肠癌及癌旁组织中CDC25C与HESR-1表达的相关性在癌旁组织中,CDC25C mRNA与HESR-1 mRNA的表达无相关性(r=0.339,P=0.316);在癌组织中,CDC25C mRNA与HESR-1 mRNA的表达呈正相关(r=0.862,P=0.003)。见图3。

图3 直肠癌及癌旁组织中CDC25C与HESR-1表达的相关性

2.4 CDC25C与HESR-1表达与患者临床病理参数的关系癌组织CDC25C及HESR-1表达阳性患者的肿瘤直径和淋巴结转移率均高于表达阴性者(P<0.05)。CDC25C与HESR-1的阳性表达与患者性别、年龄、病理类型、病理分期、是否合并脉管侵犯及神经侵犯差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 CDC25C与HESR-1表达与患者临床病理参数的关系

2.5 CDC25C、HESR-1表达对患者预后的影响166例直肠癌患者的中位生存时间42个月,总体5年生存率为58.4%(97/166)。Kaplan-Meier生存分析显示,CDC25C阴性组总体生存率高于阳性组[64.8%(57/88)vs51.3%(40/78),χ2=9.178,P=0.002]。HESR-1阴性组总体生存率高于阳性组[79.7%(55/69)vs43.3%(42/97),χ2=13.521,P<0.01]。见图4。

图4 CDC25C、HESR-1表达对患者预后的影响

2.6 影响直肠癌患者预后的Cox多因素分析Cox多因素分析结果显示,肿瘤直径、淋巴结转移、CDC25C阳性及HESR-1阳性是影响直肠癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)。见表2。

表2 影响直肠癌患者预后的Cox多因素分析

3 讨论

直肠癌的发病率和死亡率在全球范围内保持上升趋势,居高不下[9]。早期诊断和治疗有助于提高患者生存率。本研究发现,癌组织中CDC25C、HESR-1的阳性率均高于癌旁组织。RT-qPCR及Western Blot检测进一步证实,癌组织中CDC25C与HESR-1的mRNA及蛋白表达水平均显著高于癌旁组织,结果提示CDC25C、HESR-1参与直肠癌的发生。CDC25C是一种磷酸酯酶家族成员,负责特定的蛋白磷酸化修饰,参与细胞周期调控。在正常细胞中,CDC25C通过促进细胞周期依赖蛋白激酶(CDK)的磷酸化,参与调控G2/M期的转换,促进细胞有丝分裂进而促进细胞周期的进展[10]。在恶性肿瘤中,CDC25C的异常表达或功能失调会导致细胞周期异常,进而影响肿瘤进展。有研究发现,CDC25C具有促进瘤细胞增殖和抗凋亡作用[11-12],另外CDC25C通过调节细胞骨架重组和相关信号通路的激活,促进癌细胞的迁移和侵袭[13]。HESR-1是一种转录因子,与细胞增殖、细胞分化和细胞迁移等有关[14]。有研究发现,HESR-1通过影响瘤细胞上皮间质转化、调节肿瘤干细胞特性、促进血管生成等,促进肿瘤的发生发展[14-16]。本研究发现,癌组织CDC25C及HESR-1表达阳性患者的肿瘤直径和淋巴结转移率均高于表达阴性者,说明二者均参与直肠癌进展。

本研究相关性分析发现,CDC25C和HESR-1在直肠癌组织中的表达呈正相关,说明二者可能通过协同作用在直肠癌进展中发挥作用。在癌旁组织中,二者的表达则没有相关性,其原因可能与肿瘤细胞异质性、染色质结构和调控元件的变化、转录调控机制的差异等有关[17-19]。

本研究发现,癌组织CDC25C阴性及HESR-1阴性患者的生存率较高,且CDC25C阳性及HESR-1阳性是影响直肠癌患者预后的独立危险因素,说明二者可能成为早期评估直肠癌患者生存预后的指标。

综上所述,HESR-1和CDC25C在直肠癌组织中表达升高,二者表达水平与肿瘤直径和淋巴结转移率有关,此外二者高表达与患者不良生存预后有关。提示HESR-1和CDC25C参与直肠癌发生发展,可能成为直肠癌诊断与治疗的标志物。本研究也存在一些局限性,例如样本量小,未检测患者血清HESR-1和CDC25C变化,未分析HESR-1和CDC25C的作用机制。未来需要开展细胞和动物研究,进一步探讨HESR-1和CDC25C的作用机制。