苗药组方熏蒸疗法对家兔早期膝骨性关节炎模型的差异基因分析及聚类分析*

张力文，王兴桂，李 春，庞 平

贵州中医药大学，贵州 花溪 550025

膝骨性关节炎（knee osteoarthritis，KOA）作为骨科常见疾病，在临床上主要见于40 岁以上人群，年龄越大，患病率越高，女性发病多于男性［1］。主要临床表现为膝关节肿胀、疼痛、僵硬、畸形及关节活动障碍，严重者可出现膝关节内、外翻，导致行走困难，严重影响人们的生活质量。近年来人口的老龄化趋势加剧，早期KOA 患者日益增多［2］。研究表明，慢性劳损、肥胖、遗传、气候、饮食、细胞因子异常及自身免疫反应等因素与早期KOA 的发病有密切联系，其中遗传因素是早期KOA 发病的最重要因素。同时，国内外众多研究者认为基因变异是早期KOA 的发病的关键因素。申成凯等［3-4］发现白细胞介素1、转化生长因子β1的基因变异可加重早期KOA 的患病风险。流行病学研究表明，KOA 影响因素是众多的，但是影响KOA进展的关键因素是遗传因素［5-7］。现在基因表达方面的研究主要依靠基因芯片的检测技术，治疗KOA 的研究重点是找寻易感部位，因此运用基因芯片检测技术筛选出的差异基因表达，可作为KOA 早诊断和靶向治疗的生物标记物［8］。前期实验表明，苗药熏蒸疗法可以改善早期KOA 的关节运动，同时具有很好的止痛作用，苗药熏蒸疗法主要是经皮直接作用，使熏蒸产生的药气通过皮肤黏膜渗入，是苗医独特的“以毒攻毒”治疗方法，具有操作简便、绿色、副作用小等特点。但是这种治疗早期KOA 的外治疗法的具体机制以及其在基因表达谱方面有何改变，目前尚不清楚，因此本研究的主要目的是探索苗药熏蒸疗法治疗早期KOA 在基因表达谱方面的改变，以期探明其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物3 月龄新西兰兔40 只，雌雄各半，体质量（0.50±0.10）kg，由广州医科大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SCKK（黔）2018-0001。饲养条件：在室温下标准育成饲料饲养，自由饮水，饮用干净的自来水，饲养室温度控制在24 ℃～25 ℃，相对湿度控制在7%左右。

1.2 实验药物经贵州中医药大学周汉华教授鉴定的贵州苗族熏蒸外用处方［9］，药物组成：透骨香30 g，艾纳香30 g，白龙须6 g，大血藤10 g，五香血藤10 g，土一枝蒿10 g，艾叶10 g 等。将上述药物煎煮成68%～70%药液后备用。

1.3 试剂及仪器HB-4000 型中药熏蒸机（苏州好博医疗器械有限公司）；SIM-E124 型制冰机（三洋）；Leica2135 型切片机（泰州市开发区鹏翔机械设备有限公司）；TXS-SP2 型激光共聚焦显微镜（德国LEICA 公司）；TRIzol（Invitrogen 公司）；Eukaryotic Poly-A RNA Control Kit（Affymetrix，批号：900433）；Ambion® WT Expression Kit※（Affymetrix，批号：4011974）；WT Terminal Labeling Kit：（Affymetrix，批号：900671）；4-20% TBE Gel、1.0，mm、12，well（Invitrogen，批号：EC62252）；SYBR Gold（目录号：S-11494）；Molecular Probes10 bp DNA ladder（Invitrogen，批号：10821-015）；100 bp DNA ladder（Invit-rogen，批号：15628-019）；NeutrAvidin Biotin Binding Protein（Pierce Chemical，批号：31000）；Eukaryotic Hybridization Control Kit（Affymetrix，批号：900454）；Hybridization、Wash、and Stain Kit（Affymetrix，批号：901667）；Hybridization Module from Box 1（Affymetrix 5X WT Hyb Add1，批号：901618）；Wash Buffers A and B from Box2（Affymetrix，批号：901625）。

1.4 造模方法按照文献［10］的造模方法：将含量为1.6%的木瓜蛋白酶0.5 mL 注入兔的右侧膝关节腔内，隔3 天后再注射1 次，共2 次。造模成功后，随机抽取2 只，通过观察其关节外形变化、光镜观察及Mankin，s评分［11］鉴定是否造模成功。

1.5 分组及处理将40 只3 月龄新西兰兔随机分为空白组、模型组、苗药熏蒸组、清水组，每组10 只。空白对照组：普通饲料喂养，不造模，每天驱赶其不停运动20 min。模型对照组：普通饲料喂养，造模后每天驱赶其不停运动20 min。苗药熏蒸组：普通饲料喂养，造模的第1 天就开始熏蒸治疗，每天将提前煎好的药液放于熏蒸器里，加热到39～40 ℃时，开始熏蒸治疗，每次10 min。清水熏蒸组：普通饲料喂养，造模的第1 天就开始熏蒸治疗，每天将清水放于熏蒸器里，加热到39～40 ℃时，开始熏蒸治疗，每次10 min。当治疗满20 天后处死。

1.6 取材方法将上述处死后的兔右膝关节软骨，用1%DEPC 水冲洗后，用切取l cm×l cm 全层软骨，用低温PBS 液反复冲洗后，置于冻存管内迅速放入液氮罐中。

1.7 观察指标

1.7.1 软骨的RNA 提取法 将取得的软骨组织称量后研磨成粉状，然后放于含有Trizol 液的离心管中。总RNA 的提取是参照异丙醇沉淀法［12］；纯化按照试剂盒说明书来操作，最后置于-20 ℃中保存。

1.7.2 软骨组织的基因表达谱的测定 采用异丙醇沉淀法提取total RNA，取2 μL 提取出的RNA，进行电泳，通过28S、18S 条带的清晰度判断RNA 的纯度，当RNA 的吸光度值（A260/A280、A260/A230）和浓度是1.8～2.0 时，说明RNA 的纯度高。然后行基因表达谱芯片检测程序，所有的芯片检测及数据汇总由北京博奥生物医学科技有限公司完成。

1.8 统计学方法将基因芯片检测获得的数据，导入分析软件，得到ratio值后，使用GeneAtlas™Workstation 将芯片的荧光扫描图像保存成.ga.DAT文件，并进行数据预处理。用RMA算法预处理数据，并进行DEG 分析，然后将每个样品的全基因表达，进行聚类分析，数据的分析由北京博奥生物医学科技有限公司完成。

2 结果

2.1 软骨组织的RNA 提取结果RNA 纯度：A260/280≥1.70，RNA 总量：总量≥1 µg，符合实验要求。RNA 完整性：RNA 样品电泳条带清晰，28S：18SrRNA条带亮度大于或接近1∶1，质量符合实验要求。见图1，表1。

图1 实验组电泳图

2.2 聚类分析结果每个组别的标本大体可归为一类，每个标本重复性好，每个治疗组与对照组的基因表达有各自特点，软骨组织改变是KOA 发生发展的关键，且通过苗药熏蒸治疗后它的分子机制及基因表达发生特殊改变。见图2。

图2 实验样品的聚类分析结果（具体编号同电泳图）

2.3 芯片杂交扫描结果各组荧光信号强度较高、背景均一，未见缺陷，符合基因芯片结果分析的标准。

2.4 芯片杂交结果分析散点图结果模型对照组与空白对照组比较基因表达上调，差异显著且数量最多，进一步分析得出苗药熏蒸组与模型对照组相对清水熏蒸组与模型对照组比较，有差异的基因最显著且数目最多。见图3—5。

图3 清水熏蒸组与模型对照组重叠的散点图比较

图4 苗药熏蒸组与模型对照组重叠的散点图比较

图5 模型对照组与空白对照组重叠的散点图比较

2.5 DEG总体分析结果

2.5.1 模型对照组与空白对照组重叠后差异基因 对两个样本分别进行差异基因的分析，进行重叠后鉴定出差异基因总数共23283个，其中827个基因表达差异显著，392 个下调，435 个上调，大于2倍308个，大于3倍60个，大于4倍20个，大于5 倍18 个，大于6 倍7 个，大于7 倍12 个，大于8 倍4 个，大于10 倍1 个，大于11 倍2 个，大于13 倍1个，大于16倍1个，大于17倍1个。由于目前研究兔子很多基因的功能和名称等还不清楚，大量的查阅文献，将目前已知学术界认同的影响KOA 发生发展相关的模型对照组显著表达的基因进行简单描述。见表2。

表2 模型对照组影响KOA发生发展显著表达的基因

2.5.2 苗药熏蒸组相对模型对照组重叠后差异基因 对两个样本分别进行差异基因的分析，进行重叠后鉴定出差异基因符合有效信号标准的基因总数共23283 个，与模型组相比较苗药熏蒸组存在差异表达显著的基因有208 个，96 个下调，112 个上调，大于2 倍87 个，大于3 倍10 个，大于4倍4 个，大于5 倍4 个，大于6 倍1 个，大于7 倍2个，大于9 倍1 个，大于12 倍1 个，大于20 倍1 个，大于24倍1个。由于目前研究兔子很多基因的功能和名称等还不清楚，大量的查阅文献，将目前已知学术界认同的影响KOA 发生发展相关的苗药熏蒸组显著表达的基因简单描述。见表3。

2.5.3 清水熏蒸组相对模型对照组重叠后差异基因 对两个样本进行差异基因分析，进行重叠后鉴定出符合有效信号标准的基因总数共23283个，其中有152 个基因表达显著差异，93 个上调，59 个下调，大于2 倍63 个，大于3 倍18 个，大于4倍的有6 个，大于5 倍的有1 个，大于6 倍的有2个，大于9 倍的有1 个，大于11 倍的有1 个，大于19 倍的有1 个，由于目前研究兔子很多基因的功能和名称等还不清楚，大量的查阅文献，将目前已知学术界认同的影响KOA 发生发展相关的清水熏蒸组显著表达的基因进行简单描述，见表4。

表4 清水熏蒸组影响KOA发生发展显著表达的基因

2.5.4 3 组重叠差异基因表达数目 通过上面描述，我们对三组重叠差异基因表达数目进行比较。见表5。

表5 3组差异基因统计表

3 讨论

KOA 是中老年人群的常见病与多发病，女性发病率高于男性，临床主要以膝关节肿胀、变形、疼痛、活动受限为主要临床表现［13］。人体最重要的负重关节是膝关节，人体的行走、运动等功能的正常与否直接与膝关节息息相关，KOA 的发生会使人体活动受限，而且KOA 患者会有不同程度的疼痛，严重降低了患者的生活质量，导致患者长期缺乏锻炼而发生其他疾病。目前KOA 的发病机制还不清楚，目前治疗KOA 以西医对症治疗为主，可以改善患者关节功能、缓解临床症状，病情进展时时采取手术疗法，但是治疗的效果有限，费用昂贵、容易复发、副作用大［14］。

本研究采用的苗药熏蒸疗法是贵州地区治疗KOA 最常用的治疗方法，历史悠久且应用基础良好。我们在前期开展了相关的一系列实验研究及临床研究，证明本苗药经验方治疗KOA 疗效显著。随着现代医学及分子生物的发展，相关研究表明对KOA的发生具有决定性作用的是遗传因素［15-17］。因此通过研究苗药经验方治疗KOA 的差异性基因的筛选和研究将为早期KOA 的诊治、预防、诊断提供理论依据及参考。基因芯片检测技术融合了分子生物学、计算机信息技术等众多学科技术，作为一项研究基因组前沿生物技术，具有多样化、自动化、微型化、高通量及高集成等优点。

本研究发现：1）空白对照组与模型对照组差异表达基因有827 个，435 个上调，392 个下调，通过分析这些差异基因与早期KOA 软骨组织的改变，得到一系列与KOA相关基因。有研究发现KOA的发生原因是关节软骨的降解，这与MMPs 在滑膜组织中的显著表达有关［18］。在本研究中，我们发现促进软骨细胞外基质降解的基质金属蛋白酶MMP14（NM-001082793）等基因上调，抑制软骨细胞外基质降解的蛋白酶抑制剂TIMP4（NM-001195690）等基因下调，模型成功的关键与软骨细胞外基质降解、软骨细胞凋亡导致软骨损伤有关。模型组中BCL2L1（NM-001082135）基因发生上调，该基因可促进软骨细胞的凋亡，因此该基因的差异表达与本模型复制成功相关，同时在研究中我们还发现本实验模型的复制成功与影响细胞增殖的核糖体蛋白类RPL22（ENSOCUT00000028925）、LOC100354714（XM-002718133）、LOC100352995（XM-002709326）等基因表达有关，因为在本研究中它们均发生了下调。总之，通过对模型对照组差异基因进行分析，发现本模型复制是成功的，且得出KOA 是一种多基因疾病。2）苗药熏蒸组与模型对照组差异基因有208 个，有112 个上调，有96 个下调。通过整体分析这些差异基因与KOA 软骨组织的改变，得到一系列与KOA表达相关的差异基因。我们发现，苗药熏蒸疗法可以促进细胞增殖KGF（NM-001195837）、微纤蛋白类MFAP5（ENSOCUT00000-002406）等上调，可以通过增强软骨细胞的活性，抑制软骨细胞的凋亡，从而延缓关节软骨退变。同时本课题还发现苗药熏蒸疗法可以上调保护软骨周围组织不被过度的酶解，保证弹性蛋白酶发挥正常，这是通过被抑制的组织蛋白酶ECTSE（NM-001082244）实现的。与细胞免疫相关的中性粒细胞激活肽ENA-78（AF123437）基因、巨噬细胞清道夫受体MSR1（NM-001082248）基因等上调，和能量相关及内吞的肌联蛋白TTN（Y18102）基因、整合素ITGB8（NM-001082304）等上调，调节炎性因子的趋化配体CCL14（ENSOCUT00000027247）等下调，苗药熏蒸疗法可以通过提高能量代谢、增加细胞免疫、抑制炎症和促进内吞作用来延缓KOA 的发生发展。3）清水熏蒸组与模型对照组有152个差异基因，有93个上调，59个下调，通过分析我们得出，细胞免疫相关中性粒细胞激活肽ENA-78（AF123437）等上调，能量相关的辅肌动蛋白ACTN3（X62075）基因等上调，清水熏蒸法可以通过它的热疗法来提高能量代谢、增加细胞免疫等作用来缓解KOA关节软骨的发生发展。4）通过研究我们发现苗药熏蒸法与清水熏蒸法延缓早期KOA 的关节软骨退变，但是苗药熏蒸的差异基因更为显著（＞20 倍的差异基因有2 个）：而与能量相关的MYL1（NM-001101713）基因上调（＞24 倍），苗药熏蒸有208个基因发生显著差异，清水熏蒸仅有152 个基因发生显著差异。进一步分析这些DEG，苗药熏蒸DEG显著表达与早期KOA的发生发展密切相关，因此苗药熏蒸疗法延缓早期KOA 的发生发展可以通过它的药疗和热疗共同作用来实现，疗效优于清水熏蒸法，今后我们将进一步探讨起作用的“关键基因”。

综上所述，通过基因芯片检测技术筛选出与早期KOA发生发展相关的差异基因，发现早期KOA的发病是多基因的共同作用，进一步对这些基因进行分析，可以找到苗药熏蒸疗法治疗KOA 的关键基因，为早期KOA的诊治提供新方法、新思路。