基于网络药理学及分子对接探讨散结镇痛胶囊治疗子宫内膜异位症的分子机制*

赵秀萍，马小娜，郭亚楠

北京中医药大学第三附属医院，北京 100029

子宫内膜异位症（endometriosis，EMS，以下简称内异症）是指子宫内膜腺体和间质在子宫腔以外的部位种植、浸润的一种临床常见多发疾病，全球育龄妇女患病率约5～10%［1］。因异位内膜种植部位不同，临床表现多种多样，被认为是一种全身性多系统疾病。有报道指出EMS 可影响肝脏和脂肪组织的代谢，导致全身炎症，并改变大脑中的基因表达，导致患者出现疼痛敏感和情绪障碍［2］。

古代中医学中，无内异症的病名记载，根据其痛经、继发不孕、异位囊肿等症状可归属于“痛经”“不孕”“癥瘕”等范畴。中医理论认为异位的内膜形似离经之血，即瘀血，可作为病理产物，也可为致病因素，核心病机为胞宫、冲任气血瘀滞，临床治疗多从活血化瘀散结着手［3］。散结镇痛胶囊为妇科临床常用中成药，具有活血化瘀、散结止痛的功效，可有效治疗内异症所致的痛经、卵巢囊肿、慢性盆腔痛等［4］。网络药理学可以全方位、多角度对中药多成分的药理作用靶点进行预测、拓扑分析，并可以将药物-靶点、靶点-通路等关系抽象成网络模型图，目前已成为中医药治疗临床疾病作用机制的新兴研究技术［5］。本研究应用网络药理学及分子对接技术，从系统生物学角度探索散结镇痛胶囊治疗内异症的有效成分、作用靶点、信号通路等分子机制。

1 资料与方法

1.1 资料来源系统网络药理学是基于若干数据库及软件基础上开展的，这些数据库也成为中医药与现代生物医学之间的桥梁。本研究使用的数据库及软件主要包括：TCMSP 数据库（http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、Pubchem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、TTD 数据库（https：//db.idrblab.org/ttd/）、Drugbank数据库（https：//www.drugbank.ca/）、DisGeNET数据库（http：//www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）、Swiss Target Prediction 数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）数据库、DAVID6.8 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）、STRING 数据库（https：//string-db.org/）、PDB 数据库（https：//www.rcsb.org/）、Venny 2.1 在线绘图软件、Cytoscape3.7.2（http：∥www.cytoscape.org/）软件等。

1.2 散结镇痛胶囊活性成分及内异症交集靶点的筛选将三七、薏苡仁、浙贝母分别输入TCMSP数据库，以口服生物利用度（oral bio-availability，OB）值≥30%和类药性（drug-likeness，DL）值≥0.18 为合并筛选条件，得到各自活性成分，查找国内外文献［6-7］，筛选龙血竭的主要活性成分。通过Pubchem、TCMSP 数据库进一步获得这些成分的Smiles结构并导入Swiss Target Prediction 数据库，预测散结镇痛胶囊活性成分的靶点信息。借助TTD、Drugbank、DisGeNET 数据库检索子宫内膜异位症疾病相关靶点信息。检索关键词为“endometriosis”，删去重复值后合并数据集获得疾病靶点信息，利用Venny 2.1 工具绘制韦恩图获得交集基因。

1.3 靶点预测及核心蛋白互作网络构建构建成分-疾病靶点映射关系，运用Cytoscape 3.7.2软件构建“成分-疾病靶点”网络图，得到拓扑分析参数，经筛选后得到的核心靶点上传到STRING 数据库，进行蛋白-蛋白互作分析，保存TSV 结构，再上传Cytoscape 软件进行PPI 网络构建，利用Network Analyzer 获得自由度（degree）、中介中心性（betweenness）、接近中心性（closeness）等相关参数。

1.4 GO 功能富集分析将上述靶点信息输入DAVID 6.8 数据库Gene List，选择“OFFICIALGENE-SYMBOL”，设定基因物种和背景为“Homo sapiens”，进行GO功能富集分析，具体包括生物过程（biological process，BP）、细胞组分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）三部分，根据P-value 值选取前20 个条目，以气泡图进行可视化展示。

1.5 KEGG 通路富集分析及靶点-信号通路网络构建通过DAVID6.8 数据库选择“KEGG_PATHWAY”，进行KEGG通路富集分析，根据P-value值筛选信号通路，利用Cytoscape 软件构建活性成分-疾病靶点-信号通路网络关系图，进一步说明靶点和信号通路在散结镇痛胶囊治疗内异症的作用。

1.6 成分-靶点对接选择PPI 网络中度值靠前的靶点与药物关键成分进行对接，下载小分子配体mol2 格式。通过PDB 数据库筛选下载靶蛋白pdb结构，导入PyMOL 2.4软件进行去水、删除配体等处理。将优化后的大分子蛋白导入AutoDock-Tools，进行加氢、计算电荷数等处理，导入小分子配体，设置Gird Box 为默认值，再通过AutoDock在Windows10环境下将大分子蛋白与小分子配体进行对接，按Binding energy排序，选取结构最稳定的对接目标，将pdbqt 结构转化为pdb 结构，导入PyMOL软件将对接结果进行可视化。

2 结果

2.1 散结镇痛胶囊的活性成分与作用靶点筛选散结镇痛胶囊中包括三七、薏苡仁、浙贝母和龙血竭4 味中药。通过TCMSP 数据库及文献检索筛选，共得到散结镇痛胶囊54 个活性成分，其中三七8 个、薏苡仁8 个、浙贝母7 个、龙血竭31 个。其中beta-sitosterol 为三七、龙血竭、浙贝母的共有成分，Stigmasterol 为三七、薏苡仁、龙血竭共有成分，Mandenol 为三七、薏苡仁共有成分。保存每个化学成分的Smiles 结构，导入Swiss Target Prediction 数据库，选择物种为Homo sapiens，共预测成分靶点943个。见表1—2。

表1 药物有效成分（除龙血竭）

表2 龙血竭有效成分

2.2 内异症疾病靶点筛选从TTD、Drugbank、DisGeNET 数据库以“endometriosis”为关键词检索，合并后删除重复值得到EMS 靶点1088 个。将获得的药物成分靶点和疾病靶点录入Venny 2.1在线工具绘制韦恩图，两者交集部分可能即为散结镇痛胶囊治疗内异症的关键核心靶点。最终获得NR3C2、CYP19A1、MMP9、PGR、EGFR、IL-2 等231个潜在靶点。见图1。

图1 散结镇痛胶囊药物成分-靶点韦恩图

2.3 “药物成分-疾病靶点”网络构建将获得的231 个交集基因导入Cytoscape 3.7.2 软件，构建药物成分-疾病靶点网络图，利用Tool 模块中的Network Analyzer获得Degree值，Degree值越高表示节点在网络中越重要，排名前5 位成分为Stigmasterol（豆甾醇）、beta-sitosterol（beta-谷甾醇）、Mandenol（亚油酸乙酯）、Resveratrol（白藜芦醇）、pterostilbene（紫檀芪）。见图2。

图2 散结镇痛胶囊药物成分-靶点网络图

2.4 PPI 靶点蛋白网络分析将获得的231 个交集靶点蛋白进行拓扑网络分析，以degree 和betweenness 均大于中位数为条件进行筛选，共获得45 个核心靶点，以gene symbol 的形式输入STRING 数据库，限定研究物种为Homo sapiens，设置选择置信度分数score≥0.400（高置信度），隐藏无关联的节点，默认其他参数，下载保存为tsv形式后导入Cytoscape软件进行PPI互作可视化展示。中间圆形节点代表10个核心靶点，周围圆形节点为其他核心靶点，圆形越大、颜色越深表示degree 越大。可见血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、ALB、蛋白激酶B（Protein kinase B，Akt1）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、类固醇激素受体辅激活子（steroid receptor coactivator，SRC）、表皮生长因子（epidermal growth factor receptor，EGFR）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、半胱天冬蛋白酶3（recombinant caspase 3，CASP3）、抑癌基因（tumor protein P53，TP53）、前列腺素内过氧化物合酶2（prostaglandin endoperoxide synthase2，PTGS2）等位于核心基因位置。见图3。

图3 PPI 网络图

2.5 散结镇痛胶囊-内异症交集基因的GO富集分析GO 富集分析共获得328 个生物学过程（biological process，BP），74 个分子功能（molecular function，MF）和37 个（cellular component，CC）细胞组分。其中生物过程显著富集在对RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、蛋白质磷酸化的正调控、凋亡过程的负调控、内皮细胞增殖的正调控等；分子功能主要富集酶结合、转录因子结合、相同蛋白质结合、转录调控区DNA 结合；细胞组分主要富集在细胞核、蛋白质复合物、核染色质、核质等。红色圆点越大表示富集基因数量越多，颜色越红则富集越显著。见图4—6。

图4 散结镇痛胶囊治疗内异症的生物过程富集分析

图5 散结镇痛胶囊治疗内异症的分子功能富集分析

图6 散结镇痛胶囊治疗内异症的细胞组分富集分析

2.6 KEGG 通路富集分析通过DAVID 数据库对核心靶点进行KEGG 富集分析，获得102 条相关通路，按P值排序挑选出前20条信号通路，使用气泡图进行展示，见图7。可见核心靶点主要富集在癌症通路、VEGF 信号通路、HIF-1 信号通路、雌激素信号通路、TNF 信号通路等。红色气泡越大则富集基因数目越多，颜色越红富集越显著。通过Cytoscape 软件绘制“成分-疾病靶点-信号通路网络图，见图8。根据度值排序可见成分、靶点关联最主要的通路为HIF-1 信号通路、雌激素信号通路、TNF信号通路。

图7 散结镇痛胶囊治疗内异症的KEGG富集分析

图8 成分-靶点-通路网络图

2.7 药物成分-靶点对接将PPI 网络中度值排名前5 的靶点蛋白分别与散结镇痛胶囊关键成分进行分子对接验证，见表3。结合能（binding energy）小于0 提示配体与受体可自发结合，数值越低结合构象越稳定，所需结合能越低，Binding energy≤-4.0 kcal/mol 说明有较好结合活性，≤-7.0 kcal/mol表明有强的结合活性［8］。结果显示β-谷甾醇与AKT1、β-谷甾醇与SRC、紫檀芪与AKT1、紫檀芪与MAPK3 的结合能较小，分子结合构象更稳定，见图9。结合上述结果，散结镇痛胶囊有效成分与核心靶点具有较好的结合活性，β-谷甾醇、紫檀芪可能是散结镇痛胶囊对内异症发挥治疗作用的关键成分。

图9 散结镇痛活性成分与核心靶点对接图（结合能≤6.3 kcal/mol）

表3 药物成分与核心靶点的对接结果kcal/mol

3 讨论

散结镇痛胶囊中龙血竭、三七专入血分，可活血散瘀止痛；浙贝母散结消痈；薏苡仁健脾利湿。诸药合用，可使气血通畅而无瘀滞，脾气健运而无痰湿。研究表明，散结镇痛胶囊可有效减轻内异症及子宫腺肌病患者痛经症状［9］，改善子宫内膜的血管形成和血液循环、抑制平滑肌收缩、炎症反应、降低雌激素分泌，从而有效减轻临床症状［10］。

本研究在TCMSP 数据库中共得到散结镇痛胶囊有效活性成分54 个，预测成分靶点943 个。检索获得内异症靶点1088个，两者取交集后获得231个靶点，可见散结镇痛胶囊治疗内异症是通过多成分、多靶点发挥作用。借助Cytoscape软件构建成分-疾病靶点作用网络图，分析筛选有效核心成分为豆甾醇、β-谷甾醇、亚油酸乙酯、白藜芦醇、紫檀芪等，分子对接结果显示β-谷甾醇、紫檀芪具有较强的结合效能，可能是散结镇痛胶囊对内异症发挥治疗作用的关键成分。现代药理研究认为，豆甾醇作为诸多中药的关键成分之一，具有调节炎症、免疫反应、血管生成等药理作用，可通过神经系统相关通路缓解内异症患者临床症状［11］。β-谷甾醇可阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，具有抗菌、消炎、抗氧化等作用，从而对内异症起治疗效果［12］。而紫檀芪具有抗癌、抗氧化、抑制炎症因子IL-6、TNF-α等作用［13-14］。以degree 和betweenness 为条件筛选出45个核心靶点，借助STRING数据库根据度值获得VEGFA、AKT1、MAPK3、SRC 等10 个核心靶点，这些靶点涉及血管生成、细胞凋亡、炎症反应、肿瘤生成等多个生物过程。

本研究GO 功能富集分析得出散结镇痛胶囊可能影响细胞凋亡、内皮细胞增殖、细胞缺氧等多个生物学过程。KEGG 分析显示散结镇痛胶囊治疗内异症主要涉及血管内皮生长因子信号通路、HIF-1 信号通路、雌激素信号通路、TNF 信号通路等。提示散结镇痛胶囊可能通过干预雌激素的分泌、改善缺氧环境及影响子宫内膜血管形成等作用来对内异症起治疗作用。

综上所述，散结镇痛胶囊可通过多成分、多靶点、多通路协同作用治疗内异症，为从分子机制探讨中医药治疗内异症疾病的研究提供了一定依据，但该研究是基于在线数据库及生物信息软件计算得出的，结果可能存在一定偏差，还需进一步通过临床试验及动物实验进行验证。