基于网络药理学和分子对接探讨健脾疏肝方治疗非酒精性脂肪性肝病的作用机制*

姜 慧，李军祥，谭 祥1，，张 阳1，，万 雯1，，施晓军1，，韩海啸△

1 北京中医药大学，北京 100029； 2 北京中医药大学东方医院，北京 100078；3 山东中医药大学附属医院，山东 济南 250014

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是肝细胞脂肪的过度积累，从非酒精性单纯性脂肪肝（simple nonalcoholic fatty liver，NAFL）到非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH），并可能发展为肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）［1-2］。近年来，NAFLD 已成为最常见的慢性肝病，影响了全球约25%的普通人群［3］。目前，临床上仍没有获得批准的治疗的NAFLD药物［4］。因此，探索和开发有效的NAFLD药物疗法非常重要。

中医药历史悠久，具有“多成分、多靶点”的特点，其临床疗效也得到普遍认可［5］。健脾疏肝方是北京中医药大学东方医院李军祥教授以“肝病实脾”理论为依据，谨合“肝郁脾虚，湿热瘀阻”病机，并根据多年的临证经验而创立的经验方。本方主要由绞股蓝、水飞蓟、炒白术、广郁金、茯苓、白芥子、泽泻、决明子、丹参、生山楂等十味中药组成。然而，健脾疏肝方的分子机制仍不清楚，需要进一步探索。网络药理学是一种基于系统生物学的新方法，与中草药多组分、多靶点作用的特点相契合，已被证明适用于分析中草药中各种成分和作用的复杂关系［6］。本研究采用网络药理学研究健脾疏肝方治疗NAFLD的活性化合物、靶点及其作用机制，为该方的临床应用及进一步研究提供支撑。

1 资料与方法

1.1 健脾疏肝方活性成分和靶标的筛选将健脾疏肝方中的中药材的名称输入中药系统药理学数据库与分析平台［7］（TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），设定口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，药物利用度（drug-likeness，DL）≥0.18，以获得中药材中合格的有效成分。TCMSP 数据库没有录入的中药信息从已发表文献中获得。然后在TCMSP 数据库中查询中药对应的蛋白靶标，利用UniProt蛋白序列资源［8］（https：//www.uniprot.org）查询蛋白靶标的基因名称和规格ID，方便进一步进行研究。

1.2 药物活性成分-靶点网络的构建采用Cytoscape（V3.6.1）进行活性化合物靶网络的构建，以清晰显示网络和潜在目标之间的关系。将鉴定的活性化合物和潜在靶标导入软件。使用“Network Analyzer”模块对网络的拓扑属性参数进行分析，计算出整个网络的“Degree”值。Degree值越高，该化合物越有可能成为中草药的关键化合物。

1.3 疾病潜在作用靶点的筛选以“Non-alcoholic fatty liver disease”为检索词，在人类基因数据库数据库［9］（GeneCards，http：//www.genecards.org）、在线人类孟德尔遗传数据库［10］（online mendelian inheritance in man，omim，http：//www.omim.org/）及药物靶标数据库［11］（therapeutic target database，TTD，http：//db.idrblab.net/ttd/）检索疾病相关靶点信息，并将上述3 个数据库中的目标进行合并，删除冗余目标，得到总的疾病靶点目标。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建采用Draw Venn Diagram（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）筛选健脾疏肝方和NAFLD 的共同靶点。后将共同靶点导入STRING数据库［12］（https：//string-db.org/）构建蛋白-蛋白互作网络（protein-protein interaction，PPI）。将物种设置为“Homo sapiens”（智人），最小交互阈值设置为“high confidence”（≥0.700），其他参数保持默认设置，导出并保存其TSV 格式文件，后导入到Cytoscape（V3.6.1）软件中进行可视化分析。

1.5 GO 和KEGG 富集分析利用DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）获得靶点GO 和KEGG 信号通路富集分析结果，并将所得结果导入微生信云平台（http：//www.bioinformatics.com.cn/）进行可视化分析。

1.6 分子对接验证将核心化合物和关键靶基因进行分子对接验证。首先，从PubChem 平台（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载活性化合物的三维分子结构，并使用openbabel（v3.1.1）软件将SDF文件转换为mol2格式。然后在UniProt 数据库和PDB 数据库（http：//www1.rcsb.org/）中搜索所选基因编码的受体蛋白，下载蛋白的3D结构。用PyMOL（v2.3.0）软件去除受体蛋白中的水分子。用AutoDock tools（v1.5.6）软件对蛋白质进行氢化并计算电荷。最后利用AutoDock Vina（v1.1.2）分子对接软件验证。

2 结果

2.1 健脾疏肝方的活性成分和靶标信息通过TCMSP 数据库和已发表文献筛选，删除重复项后，共获得符合OB≥30%、DL≥0.18 的潜在活性成分共117 个，其中绞股蓝15 种、水飞蓟9 种、决明子13种、泽泻7 种、白术4 种、茯苓6 种、郁金3 种、丹参58 种、白芥子1 种、山楂9 种。在这些活性化合物中，槲皮素是绞股蓝、水飞蓟和山楂的常见化合物；谷甾醇是绞股蓝、泽泻、郁金和山楂的常见化合物；豆甾醇是水飞蓟、决明子和山楂的常见化合物；木犀草素是丹参和山楂的常见化合物；CLR 是绞股蓝、水飞蓟和决明子的常见化合物。根据TCMSP数据库中的靶基因预测系统，删除重复值后共获得279 个潜在靶标，其中绞股蓝161 个、水飞蓟187个、决明子64个、泽泻5个、白术18个、茯苓23个、郁金67个、丹参134个、白芥子17个、山楂198个。

2.2 活性成分-靶标网络构建为了进一步说明健脾疏肝方活性成分与相应靶标的相互作用，构建了化合物靶标网络图，见图1。该网络由404个节点（115 个活性成分，279 个靶标，10 个药草名称）和2071 条边组成。根据网络拓扑值筛选健脾疏肝方治疗NAFLD 的关键活性成分，并将大于degree 中位数2 倍值、介数中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）中位数作为筛选指标，见表1。槲皮素、木犀草素、豆甾醇、山柰酚等高度值活性化合物可能是健脾疏肝方治疗NAFLD的重要活性成分。

表1 健脾疏肝方中筛选活性化合物的基本信息

图1 健脾疏肝方潜在靶点的复合靶标网络

2.3 NAFLD 的潜在靶基因从GeneCards、OMIM和TTD 数据库中分别收集到806 个、622 个和4 个已知的NAFLD 相关靶点，取并集后共得到1362 个疾病靶点信息。

2.4 PPI网络构建首先Venn图分析得出了133个健脾疏肝方和NAFLD 的共同靶点，这些靶点是健脾疏肝方治疗NAFLD的潜在靶点，见图2。然后将133个靶点上传到STRING数据库中，PPI评分设为0.700的高置信度。后将结果导入Cytoscape软件进行进一步分析。根据CytoHubba插件中的MCC方法，获得排名前50 的核心基因，见表2、图3。

表2 排名前50的核心基因

图2 健脾疏肝方治疗NAFLD的Venn图

图3 健脾疏肝方治疗NAFLD的PPI靶点网络图

2.5 GO 和KEGG通路富集分析为了进一步了解交集基因的功能，利用DAVID 数据库对健脾疏肝方治疗NAFLD的50个核心靶点进行GO功能富集分析以及KEGG信号通路富集分析。设定筛选条件为P＜0.01，GO 富集分析得到生物过程（biological process，BP）主要包括RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、对药物的反应、细胞对脂多糖的反应等；细胞组成（cellular component，CC）主要包括细胞外间隙、胞外区、细胞质等；分子功能（molecular function，MF）主要包括酶结合、相同蛋白质结合、细胞增殖活性等。将筛选出的排名前10 的BP、CC、MF 结果通过微生信平台作柱状图进行可视化分析，见图4。

图4 排名前50核心基因的GO富集分析柱状图（BP、CC、MF）

KEGG 信号通路富集分析筛选共得到104 个富集条目（P＜0.01），主要包括癌症相关通路、TNF信号通路、乙型肝炎、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路及NAFLD 信号通路等。将筛选出的排名前20 的通路通过微生信平台作气泡图进行可视化分析，见图5。该结果表明，中医药可从多靶点、多途径干预本病，对NAFLD 的发生、发展和预后发挥积极作用。

图5 排名前50核心基因的KEGG通路富集分析气泡图

2.6 分子对接将健脾疏肝方主要活性成分槲皮素、木犀草素、豆甾醇、山柰酚与潜在主要治疗靶点蛋白IL-6、TNF、STAT3、PTGS2、VEGFA进行分子对接验证，计算结合能，并将结合能≤-5 kcal/moL作为说明受体蛋白与药物活性成分可能具有较好的结合活性的标准［13］，将最小结合能进行展示，见表3。其中结合活性较强的化合物与靶蛋白分子对接模式见图6。结果显示，健脾疏肝方主要活性化合物可与靶点受体蛋白通过氢键等分子间作用力形成较为稳定的构象。

表3 分子对接结合能kcal/moL

3 讨论

NAFLD 是最常见的肝脏疾病之一，是一种多因素发病机制和多种临床表现的系统性、代谢性疾病［14］。NAFLD 发病机制复杂，胰岛素抵抗、氧化应激、炎症反应、脂质过氧化及内质网应激等均在本病的发生和发展中扮演着重要角色［15］。目前尚未研制出特效药物，而中医药在代谢性疾病的防治中具有较为确切的疗效［16］。健脾疏肝方是北京中医药大学东方医院脾胃肝胆科李军祥教授治疗NAFLD 的临床经验方，临床应用疗效显著［17］。课题组前期研究发现，健脾疏肝方具有降低NASH 大鼠肝脏的脂质沉积、改善组织炎症状态、对抗氧化损伤等作用［18-19］，不过具体的作用机制还有待进一步阐释及明确。网络药理学能够系统地识别药物与疾病的关系，揭示多分子药物协同作用的优势［20］。本研究通过网络药理学和分子对接方法筛选健脾疏肝方的有效成分和治疗靶点，并进行基因功能分析和KEGG 通路富集分析，以期进一步阐明健脾疏肝方治疗NAFLD的机制。

从药物活性成分-靶点网络图可以看出，网络中的每个活性化合物都与多个靶点蛋白相连，说明健脾疏肝方治疗NAFLD 的多成分、多靶点的生物学特性。其中槲皮素、木犀草素、豆甾醇、山柰酚是健脾疏肝方主要的活性化合物，起到关键的治疗作用。槲皮素是一种具有多种生物活性的多羟基黄酮类化合物，具有很高的药用抗炎、抗癌、抗氧化及抗纤维化价值［21-22］。木犀草素是一种在许多中药及蔬菜中存在的天然类黄酮，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用［23-24］。豆甾醇是存在较为广泛的一种植物甾醇，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤及降低胆固醇等作用［25］。研究证明，豆甾醇可较明显改善NAFLD 肝细胞脂肪变性程度，并减轻氧化应激反应［26］。山柰酚是一种植物来源的类黄酮化合物，具有诸多药理特性，如减少氧化应激反应、抗肿瘤和抗炎作用等。有报道称山柰酚对PI3K/Akt 通路和环氧化酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）有抑制作用［27］。

本研究构建了健脾疏肝方和NAFLD 共有的133靶标的核心基因的PPI网络。在这些指标中，IL-6、TNF、STAT3、PTGS2 和VEGFA 被认为是显著的，是健脾疏肝方干预NAFLD 潜在的理想靶点选项。TNF 和IL-6 作为炎症介质，当肝脏受损时可诱发炎症反应，从而引起肝细胞变性、坏死和纤维组织增生［28］，因此二者在NAFLD 发病机制中起着重要作用。研究发现，槲皮素可以通过抑制IL-6、TNF-α 的产生，起到改善NAFLD 的作用［29］。PTGS2又可称作COX-2，是一种较为重要的生理酶，在炎症和肿瘤疾病中发挥作用，是药学界存在较高关注度的靶点分子之一［30-31］。研究发现，COX-2酶上调导致前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）水平升高，而PGE2有促炎作用的同时具有抗炎作用，所以COX-2 酶代谢产物的战略性调控可用于治疗性控制炎症疾病的进展［32］。STAT3 是STAT 家族成员之一，在人类恶性肿瘤的各种细胞因子、激素和生长因子的信号传导中起着关键作用［33］，研究认为STAT3 可能是抗癌治疗的新靶点［34-35］。相关研究报道，槲皮素可能通过调节JAK2/STAT3 信号通路，达到抑制肝癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，并且促进肝癌自噬的作用［36］。研究发现，VEGFA的表达与NAFLD 具有一定的相关性［37］。由以上分析结果得出，IL-6、TNF、STAT3、PTGS2 和VEGFA 等靶点可能是健脾疏肝方治疗NAFLD 的关键靶点蛋白。此外，健脾疏肝方主要活性成分与这些靶点的对接结果也进一步证明了健脾疏肝方对NAFLD 具有治疗作用。

GO 分析结果显示，健脾疏肝方干预NAFLD 在生物过程方面最可能与RNA 聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、对药物的反应、细胞对脂多糖的反应、炎症反应等相关，在细胞组分方面最有可能与细胞外间隙、胞外区、细胞质、细胞表面等组成成分相关，而在分子功能方面则最可能与酶结合、相同蛋白质结合、细胞因子活性、转录因子结合等相关。KEGG 分析显示，与健脾疏肝方治疗NAFLD 有关的通路主要涉及癌症相关通路、TNF 信号通路、MAPK 信号通路、PI3K-Akt 信号通路及NAFLD 信号通路。其中，癌症相关通路排在首位，说明健脾疏肝方在很大程度上发挥抗肿瘤的积极作用，这也与药物成分-靶点网络分析结果相互印证。研究发现，TNF信号通路是炎症反应的重要通路［38］，也是与NASH 纤维化密切相关的因子［39］。NAFLD 信号通路和AMPK信号通路在NAFLD的发生发展中起到重要作用。其中胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）信号通路是NAFLD 信号通路中的主要通路之一，IR 在NAFL 向NASH 发展过程中发挥重要作用，并且IR 已被证实是NAFLD 的独立危险因素，是NAFLD 进展的关键［40］。AMPK 的激活可促进下游抗氧化基因Nrf2 的表达，减轻氧化应激，抑制炎症反应［41］。PI3K/Akt 在介导生长因子信号在生物体生长、葡萄糖稳态、脂质代谢等方面起着重要作用，是一个潜在的治疗NAFLD 的靶点［42］。研究表明，槲皮素能通过调控PI3K/Akt/NF-κB 信号通路改善NASH 大鼠肝组织脂肪变性程度，从而减轻肝脏炎症［43］。

综上所述，本研究主要采用网络药理学与分子对接方法，对健脾疏肝方治疗NAFLD 的主要活性成分、靶点间的相互作用进行探讨。研究结果表明，健脾疏肝方可能通过炎症反应、氧化应激、胰岛素抵抗及脂质代谢等多种途径干预NAFLD，其中槲皮素、木犀草素、豆甾醇和山柰酚为健脾疏肝方潜在的最核心化合物，IL-6、TNF、STAT3、PTGS2 和VEGFA 五个靶蛋白为干预网络中潜在的最佳靶点选项。本研究在一定程度上对中医治疗疾病提供理论依据具有很大的价值，为中药复方作用机制提供了新方向。但是，由于网络药理学是基于现有文献和数据库平台中的数据，如果这些数据存在偏差，网络药理学的结果就会不准确，这也是预测的局限性所在。因此，关于健脾疏肝方在NAFLD 中的作用，还需进行进一步的临床和基础实验验证。