基于网络药理学探讨茵黄解毒汤治疗HBV相关肝衰竭的活性成分及其作用机制*

曾胜澜，王 娜，张荣臻，王挺帅，吴 聪，毛德文△

1 广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023；2 湖南中医药大学，湖南 长沙 410000；3 广西中医药大学，广西 南宁 530023；

肝衰竭是由多种因素引起的严重肝脏损害，导致肝脏合成、解毒、代谢和生物转化功能严重障碍或失代偿，出现以黄疸、凝血功能障碍、肝肾综合征、肝性脑病、腹水等为主要表现的一组临床证候群，具有发病急、病情重、传变快、病死率高等特点［1］。在我国，HBV 感染者高达7000 万，HBV 是引起肝衰竭的主要病因［2］。目前，如何有效促进肝再生、拮抗肝细胞坏死、抑制HBV 复制、提高机体免疫、减轻内毒素血症、抗感染等是肝衰竭防治的重点。

茵黄解毒汤是由茵陈蒿汤联合黄连解毒汤组成，方中重用茵陈为君药，苦泻下降，善于清热利湿，为黄疸之要药；臣以黄芩泻肺火于上焦，黄连泻脾火于中焦，黄柏泻肾火于下焦，栀子通利三焦，助茵陈引湿热从小便而去；佐以大黄泻热逐瘀，通利大便，导瘀热从大便而下，共奏清热利湿、泻火解毒之功。研究证实，茵陈蒿汤合黄连解毒汤具有护肝、抗HBV、降低内毒素、减轻促炎因子等作用［3-5］。

鉴于肝衰竭的机制复杂，单一的治疗手段无法奏效，而中医药复方具有“多成分-多靶点-多途径”的特性，遵从“君、臣、佐、使”的配伍原则。因此，支持及开展中药复方防治肝衰竭的研究显得尤为重要。微阵列等基因表达分析的高通量平台是推断生物相关性的重要工具，特别是在构建信息系统过程中的复杂网络。目前，尚无对茵黄解毒汤治疗HBV-LF的全基因组学研究。在本研究中，我们从基因表达总集（gene expression omnibus，GEO）得到了有文献记载的原始数据，从中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology，TCMSP）得到了茵黄解毒汤的有效化合物及其相关靶点，进行生物功能注释、PPI网络、GO和KEGG等相关分析。利用生物信息学方法，可以对HBV 相关肝衰竭的作用机制进行进一步的研究，为中药复方茵黄解毒汤的临床应用和药物靶点的发现提供潜在的生物学标志物。

1 资料与方法

1.1 基因芯片数据筛选运用GEO 数据库，搜索关键词“liver failure”“hepatic failure”“hepatitis B virus”或“HBV”，设置条件Homo sapiens、series、Expression profiling by array，得到符合条件的基因表达谱GSE38941和GSE62029。

1.2 DEGs 分析将上述两组数据均分为正常组和HBV-LF 组，利用perl 合并两组数据，R 语言中sva 进行批次矫正（batch normalization），limma用于识别两个数据集中的差异基因（differentially expressed genes ，DEGs），阈值设为|log2FC|＞1，adjustPvalue＜0.05。R 包pheatmap绘制两个数据的DEGs热图。

1.3 中药靶点预测茵黄解毒汤共包含6 味中药：茵陈、栀子、大黄、黄芩、黄连、黄柏。利用TCMSP 数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）搜索6 味中药各自的有效化合物及其相关靶点，设置条件口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%及类药性（drug-likeness，DL）≥0.18。

1.4 疾病-中药复方靶基因运用Venny 2.1.0（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）将从GEO获取的HBV-LF靶点与中药相关靶点进行交集对比，最终获得茵陈蒿汤联合黄连解毒汤治疗HBV-LF的潜在作用靶点。

1.5 构建茵黄解毒汤治疗HBV-LF 的调控网络运用Cytoscape 构建茵陈蒿汤联合黄连解毒汤治疗HBV-LF 的调控网络，插件Bisogenet 构建蛋白互作网络（protein-protein interaction network，PPI），CytoNCA进行网络拓扑学分析。Biso-Genet 是一个新的用于基因网络构建、可视化和分析的插件，其特点是可以包含编码关系来区分基因及其产物，存储相互作用、分子络合物和路径的完整描述，以搜索所有已知的相互作用［6］。CytoNCA 是一种综合计算、评价和可视化分析的多中心性插件，计算了PPI 网络的拓扑结构和关系特征，包括：中间性中心性（betweenness centrality，BC）、度中心性（degree centrality，DC）等，适当的最小阈值由网络节点和边缘分布决定［7］。

1.6 GO 富集分析及KEGG 信号通路富集分析利用David 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）上传潜在靶蛋白，进行GO 的生物学过程（biological process，BP）、细胞组成（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）功能富集分析；同时利用KEGG 信号通路分析，综合预测茵黄解毒汤治疗HBV-LF 关键靶点的生物学特性及调控通路。

2 结果

2.1 DEGs分析GSE38941数据集包括27个样本（正常样本10 例，HBV-ALF 样本17 例），GSE62029数据集包括23 个样本（正常样本10 例，HBV-ALF样本13 例）。共得出差异基因2160 个，其中上调基因1172个、下调基因988个。见图1—2。

图1 HBV-ALF的DEGs火山图

图2 HBV-ALF的DEGs热图

2.2 中药复方靶点茵黄连解毒汤包含6 味中药，经过数据库检索及筛选，共得到化合物109个，包括beta-sitosterol、Genkwanin、Skrofulein、Isoarcapillin、Eupalitin、capillarisin、Demethoxycapillarisin、kaempferol、Stigmasterol、rhein 等，涉及相关靶点255 个，其中包含ESR1、CDK2、VEGF2、BAX、IL-6、JUN、IL-2、CXCL2 等。

2.3 疾病-中药复方靶基因及相关网络构建根据“2.1”项和“2.2”项所得结果，将GEO 数据库中筛选出的DEGs 与茵黄连解毒汤的相关靶点进行对比分析，共得到31 个靶基因，涉及66 个小分子化合物，包括Quercetin、Kaempferol、Isocorypalmine、（S）-Canadine、baicalein、beta-sitosterol、（R）-Canadine、Cavidine、Stigmasterol、wogonin、（2R）-7-hydroxy-5-methoxy-2-phenylchroman-4-one、Berlambine、Fumarine、oroxylin a、acacetin、Dehydrotanshinone Ⅱ A、aloeemodin、crocetin、isorhamnetin、berberine、Genkwanin 等。利用Cytoscape 构建茵黄连解毒汤治疗HBV-LF的调控网络。见图3。

图3 茵黄解毒汤治疗HBV-ALF的调控网络（节点大小按Degree排列）

2.4 PPI 网络及拓扑学分析运用Cytoscape 中插件Bisogenet 构建PPI 网络，将“2.3”项中得到的31 个靶基因输入Bisogenet，设置条件：Homo sapiens，protein protein interaction，数据来源为DIP、BIOGRID、HPRD、INTACT、MINT、BIND，最后得到相互作用的1927 个互作基因。运用CytoNCA进行网络拓扑学分析，设置DC＞60，BC＞600，最后得到55个关键靶基因。见图4—5，表1。

表1 网络拓扑学分析

图4 PPI蛋白互作网络图

图5 CytoNCA网络拓扑学分析

2.5 GO 和KEGG 富集分析利用David 数据库对55个关键靶基因进行GO分析，共涉及细胞组分构成或来源（cellular component organization or biogenesis）、对刺激的反应（response to stimulus）、免疫过程（immune system process）、正/负调节的生物过程（positive/negative regulation of biological process）、细胞死亡（cell killing）、细胞增殖（cell proliferation）等24 个生物学过程（biological process，BP）；催化活性（catalytic activity）、结合（binding）、转录调节（transcription regulator activity）等10 种分子功能（molecular function，MF）；细胞（cell）、胞外区（extracellular region）、细胞器（organelle）等16 个细胞组分（cellular component，CC）。见图6。

图6 GO富集分析

图7 KEGG富集分析（前20）

通过KEGG分析，共得到175条信号通路，见图7（top 20），去除与HBV-LF 无关的信号通路，并且靶基因富集数＞3，共筛选出27 条信号通路，包括PI3K-Akt signaling pathway、MAPK signaling pathway、Cell cycle、Hepatitis B、Apoptosis、Cellular senescence、FoxO signaling pathway、Ras signaling pathway、IL-17 signaling pathway、NOD-like receptor signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Wnt signaling pathway、Jak-STAT signaling pathway等信号通路等。见表2

表2 KEGG信号通路分析

3 讨论

全基因组分析（genome-wide analysis，GWAS）是一项系统的、有力的、公正的研究，探讨了常见序列及其变异与疾病易感性之间的关系［8］。鉴于目前肝衰竭的发病机制尚未完全明确，GWAS 在揭示肝衰竭的病机方面发挥着重要的作用。网络药理学将现有的“一靶一药”的研究范式更新为新的“网络靶点-多组分”的研究范式，分析生物网络中的化合物、靶点和疾病之间的关系［9］。利用GWAS并与中医药、疾病相联系构建中医药网络药理学调控网络，将从系统角度和分子水平上进一步揭示“药物-基因-疾病”共模块关联，筛选中药复方中的协同多化合物，解释中药方剂的组合规律、网络调节效应及疾病防治的相关机制。

茵黄解毒汤由6 味中药构成，涉及的小分子化合物及其药物靶点众多，通过GEO数据库、TCMSP数据库及一系列比对分析，最终筛选得到的小分子化合物及其作用靶点可能是茵黄解毒汤拮抗HBV-LF的关键物质基础。研究发现，槲皮素（quercetin）可通过降低肝脏丙二醛（malondialdehyde，MDA）、增强超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）的活性、提高B细胞淋巴瘤因子2（B cell leukemia 2，Bcl-2）的表达、减弱Bcl-2相关x蛋白（Bcl-2 associated x protein，Bax）的表达，从而起到保护肝脏的作用［10］。研究证实，槲皮素能显著降低HBsAg/HBeAg 分泌和HBV-DNA 水平，这可能与热休克蛋白水平和病毒转录水平的下降有关［11］。除此之外，槲皮素还有抗氧化、清除自由基、抗炎、提高机体免疫等作用［10，12］。研究发现，山柰酚（kaempferol）可通过抑制肝细胞凋亡，降低D- 氨基半乳糖（D-galactosamine，D-GalN）/内毒素（lipopolysaccharide，LPS），从而诱导ALF 小鼠的死亡率［13］。黄芩素（baicalein）可抑制D-Galn/LPS 诱导的ALF 大鼠细胞凋亡，其机制可能与减轻炎症损伤、调节MAPK 与NF-κB 信号通路有关［14-15］。芦荟大黄素（aloe-emodin）具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤、改善肝脏脂质过氧化等作用，可干预肝纤维化、肝硬化、非酒精性脂肪肝、肝衰竭等疾病的进展［16-18］。黄连素可降低百草枯诱导的肝细胞损伤中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的形成和乳酸盐脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的释放，抑制肝细胞中谷胱甘肽的消耗［19］。本研究显示，槲皮素、山柰酚、黄芩素、芦荟大黄素、黄连素、异鼠李素、大黄酸等作为重要的小分子化合物参与了茵黄解毒汤拮抗HBV-LF 的过程，说明本研究准确性较高。

通过Bisogenet和CytoNCA构建PPI网络及进行拓扑学分析，最后得到茵黄解毒汤-HBV相关肝衰竭的关键节点55 个，包括TP53、NTRK1、HSP90AA1、ESR1、CUL3、MCM2、CDK2、HSP90AB1、YWHAZ、NPM1、EGFR、HSPA8、VCP、FN1、BRCA1、HSPA5、COPS5、EP300等，提示茵黄解毒汤可能通过优效小分子化合物与筛选出的关键靶点相互作用，从而对HBV 相关肝衰竭起到治疗作用。TP53 是重要的抑癌基因，在诱导细胞周期阻滞、DNA 修复、衰老和凋亡方面发挥重要作用［20］；同时，也有研究发现TP53 可通过p53 途径在肝衰竭的进展和恢复阶段调节细胞凋亡［21］。研究发现，ESR1 是肝再生过程中胆红素水平下降的重要介质，而CYP2A6 是胆红素水平下降过程中雌激素信号的重要介质，ESR1-CYP2A6轴可能参与肝细胞的成熟和恢复，通过增加肝细胞数量和肝祖细胞成熟以促进肝再生［22］。ESR1甲基化可作为一个独立的危险因素，对预测HBV相关肝衰竭28 天死亡率具有较高的价值［23］。Cul3和NPM1可调节细胞周期、促进细胞增殖及抑制细胞凋亡等［24-25］。Cul3介导的原代成纤维细胞周期蛋白E 降解途径是调节细胞周期蛋白E 稳态的主要机制［24］。EGFR 及其相关信号通路对肝细胞的正常功能和肝再生都至关重要，EGF/EGFR 信号通路是人体被切除2/3 肝脏后最早被激活的信号通路之一［26］。

GO 富集分析提示BP 主要涉及细胞组分构成或来源、对刺激的反应、免疫过程、正/负调节的生物过程、细胞死亡、细胞增殖等。KEGG 通路分析提示PI3K-Akt 信号通路、MAPK 信号通路、Cell cycle、Hepatitis B、自噬、FoxO 信号通路、Ras 信号通路、IL-17 信号通路、NOD 样受体信号通路、HIF-1 信号通路、NF-κB 信号通路、Wnt 信号通路、Jak-STAT 信号通路等信号通路与本研究密切相关。PI3K-Akt 信号通路一直被认为是促进细胞增殖和防止细胞凋亡的重要途径，磷酸化Akt 作用于下游靶点，参与调控细胞增殖和凋亡的蛋白表达［27］。研究发现，在Akt 基因敲除的小鼠中，由于肝细胞增殖能力受损，肝再生严重受损，死亡率增加［28］。MAPKs 信号通路是细胞抵抗损伤的重要途径，它整合了包括生长、炎症、代谢和凋亡等多种途径［29］。肝脏内发生的自噬主要具有维持肝组织正常的结构和功能、调节肝脏三大营养物质代谢、调控肝脏免疫和炎症反应的生物学作用，对急性肝衰竭具有保护作用［30］。IL-17 主要是由活化的CD4+T细胞产生的促炎细胞因子，在介导炎症反应、免疫性疾病、肿瘤、移植排斥反应等过程中发挥重要作用［31］。说明茵黄解毒汤可通过调节细胞周期，影响细胞增殖和凋亡，调节机体免疫，抑制HBV病毒复制等方面发挥拮抗HBV-LF的作用。

综上所述，本研究借助网络药理学揭示了茵黄解毒汤防治HBV-LF 的作用机制，对筛选出的优效小分子化合物、优效靶点、优效途径进行了初步的探索。体现了中药复方具备“多成分-多靶点-多通路”的特点，揭示了其拮抗肝衰竭的作用机制。探讨茵黄解毒汤防治HBV-LF 的研究，进一步挖掘了中药复方优效的单体成分，为新药的开发提供基础，并为中医药现代化提供坚实的证据和实验支撑。